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目的:利用基因工程技术,在克隆大鼠H0—1基因的基础上,以乳酸乳球菌为载体,构建能够表达具有生物活性H0-1的重组乳酸乳球菌(Iactococcus lactis,LL),然后观察重组乳酸乳球菌在大鼠肠道的吸收情况。
方法:异硫氰酸胍/酚/氯仿(Trizol法)提取大鼠脾组织总RNA,用逆转录.聚合酶链式反应法(RT-PCR法)合成HO-1基因的cDNA,SDS碱裂解法制备质粒pSEC-E7和pGEM—HO—1,质粒酶切及连接构建pSEC—HO—1并鉴定,用电穿孔法将pSEC-HO-1导入乳酸乳球菌(LL)NZ9000,SDS-PAGE和Western blot鉴定:HO-1基因在NZ9000中表达。制备工程菌口服悬液给大鼠灌胃。
结果:克隆完整的HO-1基因cDNA经序列测定,克隆的HO-1基因序列与Genbank公布的HO-1基因的cDNA序列编码区相同。重组乳酸乳球菌(LL-HO-I)能够表达大鼠HO-1基因表达量约为7.0mg/L。LL—HO-I表达的大鼠HO-1活性为2.386U/mg/h,重组乳酸菌工程菌的HO-1在大鼠肠道2、3天时含量最多。
结论:1.成功克隆了大鼠HO—1基因;2.血红素加氧酶-1重组乳酸乳球菌能够表达具有生物活性的大鼠HO-1;3.重组HO-1能有效被大鼠肠道吸收;同时不引起大鼠肠粘膜损害。