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背景:先天性心脏病(Congenital Heart Disease,CHD)是儿科最常见的心血管疾病,从2009年至今,CHD一直是我国最常见的出生缺陷,同时也是婴儿致死的首要原因。目前世界范围的活产新生儿CHD的发病率为8‰-12‰。其中紫绀型先天性心脏病(Cyanotic Congenital Heart Disease,CCHD)是CHD最严重的一种类型,其发病率约占CHD的10%-20%。紫绀型先天性心脏病(CCHD)患儿因心脏结构异常导致低氧静脉血直接流入体循环而出现紫绀的共同临床表现,低氧血症是CCHD常见症状,也是最主要的死亡原因。CCHD患儿低氧血症较非紫绀型先天性心脏病(Acyanotic Congenital Heart Disease,ACHD)患儿更严重,长期慢性的低氧血症严重影响患儿的生长发育,耐受低氧环境是CCHD个体存活的基础。在临床中经常可以观察到相同结构畸形、同等低氧情况下,不同个体临床表现及预后均不同,说明不同个体对低氧的耐受能力不同,且CCHD个体的低氧耐受能力在一定程度上受个体遗传背景的影响。低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是一种低氧诱导产生的,可以激活低氧反应基因转录的DNA结合蛋白,从而促进细胞在低氧状态下的生存。这揭示了HIF-1α基因可能与CCHD低氧耐受存在一定相关性。国内已有研究证实慢性低氧上调CCHD患儿心脏组织HIF-1α蛋白表达,该作用可能参与CCHD患儿耐受低氧。大量研究证实许多疾病的病情进展和预后与特殊基因多态性位点密切相关,但目前HIF-1α基因多态性与CCHD低氧耐受的相关性尚不明确。目的:研究HIF-1α基因多态性和CCHD患儿低氧耐受能力的关系,揭示CCHD个体遗传背景在耐受低氧过程中的作用,为指导临床预后和个体化治疗提供理论依据。方法:抽提97例CCHD患儿和108例ACHD患儿外周抗凝血的基因组DNA;利用靶向捕获技术,针对HIF-1α外显子、3’UTR、5’UTR及转录起始位点上游2kb区域进行二代测序;对测序数据生物信息学分析筛选HIF-1α基因多态性位点;以卡方检验统计学分析比较各多态性位点等位基因和基因型在CCHD组和ACHD组中分布的差异;对关联多态性位点设计引物,PCR克隆所有样本目的DNA片段后Sanger测序,验证二代测序的正确性。根据前面的实验结果,利用PCR技术克隆HIF-1α启动子区含-1496多态位点的目的基因片段;将-1496位点不同基因型目的片段分别插入到p GL3-Basic荧光素酶报告基因载体中并酶切测序鉴定,最后构建出2种荧光素酶表达载体(p GL3-Basic-HIF-1α-AA和p GL3-Basic-HIF-1α-DD);将重组质粒脂质体法分别转染至HEK293T和H9C2细胞;用双荧光素酶检测试剂测定细胞裂解液荧光素酶活性;以SPSS17.0软件独立样本t检验和2×2析因设计资料方差分析进行统计学分析,比较不同基因型不同氧浓度下HIF-1α启动子活性的差异。结果:从97例CCHD患儿和108例ACHD患儿外周抗凝血的基因组DNA中,筛查出33个高频多态位点(最小等位基因频率MAF>10%)。其中仅HIF-1α转录起始位点上游-1496位点A>D(D代表单碱基缺失突变),在NCBI上的SNP序列号为rs138141447,其等位基因频率,CCHD组与ACHD组比较差异有统计学意义(P<0.05)。rs138141447位点Sanger测序验证结果93.2%与二代测序结果一致。Sanger测序结果作为金标准,HIF-1α启动子-1496位点,CCHD组等位基因频率A和D分别为77.8%和22.2%;ACHD组为89.4%和10.6%(χ2=10.04,P﹤0.01)。CCHD组HIF-1α启动子AA、AD、DD基因型频率分别为58.76%,38.14%和3.1%,ACHD组为78.7%,21.3%和0%(χ2=12.42,P﹤0.01)。经酶切测序鉴定,成功构建出-1496位点不同基因型HIF-1α启动子-荧光素酶报告基因载体;在HEK293T和H9C2细胞中,通过比较不同基因型荧光素酶表达载体(p GL3-Basic-HIF-1α-AA和p GL3-Basic-HIF-1α-DD)转染细胞后的荧光素酶相对活性,发现DD基因型启动子转录活性明显高于AA基因型的活性,相同氧浓度下不同基因型重组质粒荧光素酶相对活性比较有统计学差异(P<0.05),相同基因型重组质粒在不同氧浓度下荧光素酶相对活性比较无统计学差异(P﹥0.05),不同基因型和不同氧浓度的交互效应P﹥0.05,认为不同氧浓度对不同基因型重组质粒荧光素酶相对活性无影响。结论:测序结果发现HIF-1α启动子区多态性位点rs138141447,其等位基因频率和基因型频率,CCHD组和ACHD组比较差异具有统计学意义,CCHD组D等位基因频率明显高于ACHD组。该位点可能与CCHD低氧耐受存在一定的关联。荧光素酶报告基因检测实验发现DD基因型HIF-1α转录活性明显增高,再次证实了rs138141447位点是HIF-1α基因启动子区功能性突变位点,D等位基因是保护型等位基因,而且进一步说明携带rs138141447位点DD基因型的个体耐受低氧的能力更强,主要通过上调HIF-1α基因的转录水平而实现。