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背景:膀胱癌（Bladder cancer,BC）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。2017年临床肿瘤杂志发表的最新统计数据显示,膀胱癌发病率已位居美国男性最常见恶性肿瘤第4位。根据2016年的中国癌症登记中心数据统计显示,膀胱癌在男性最常见恶性肿瘤中排第5位,其发病率及死亡率在近十年成显著上升趋势。膀胱癌主要为两种类型,即非肌层浸润型膀胱癌（Non muscle invasive bladder cancer,NMIBC）和肌层浸润型膀胱癌（Muscle invasive bladder cancer,MIBC）。非肌层浸润型膀胱癌（NMIBC）具有反复复发的特点,并最终会进展为恶性程度更高的肌层浸润型膀胱癌（MIBC）。对于肌层浸润性膀胱癌（MIBC）患者,癌细胞侵袭肌层,虽然通过标准治疗方案切除膀胱并辅以全身化疗,但仍然会发生临近器官和远处转移,严重影响患者的生命健康;膀胱癌常见转移部位是肺、骨、肝等,膀胱癌病人一旦发生转移其五年生存率不足50%。目前,对于转移性膀胱癌除以铂类药为基础的系统化疗方案外没有好的治疗方法及治疗靶点。因此,我们拟通过体内、体外和临床组织标本实验进行检测和分析,找到膀胱癌远处转移的分子机制,进一步开发有效靶向药物、控制膀胱癌转移、提高晚期病人治疗效果。研究方法:在本课题中,我们首先建立膀胱癌高转移模型,并通过相关实验来证明高转移细胞株具有更强的干性、转移能力;我们通过基因Array分析、ELISA检测以及相关实验证实肿瘤细胞分泌的EREG是引起膀胱癌细胞转移能力增加的关键分子;接着,通过一系列实验详尽阐述EREG/EGFR信号通路在膀胱癌转移中的作用;随后我们研究发现miR-20b表达在高转移膀胱癌细胞株中下调,并且证实它能同时调节EREG、EGFR;接着,我们将在体内探索应用EGFR抑制剂吉非替尼（Gefitinib）观察其抗肿瘤疗效,以及在膀胱癌患者中分析EREG在预测膀胱癌发生和指导预后方面的作用。最后,我们检测膀胱癌病人血清EREG表达水平,并分析EREG、EGFR表达水平与膀胱癌病人生存之间的关系及临床病理参数。（1）高转移膀胱癌细胞株的建立和验证①我们将膀胱癌细胞系MB49进行培养后按5x104进行尾静脉注射;2周后我们处死小鼠,无菌操作下取出肺脏,确定肺转移灶后切取两个克隆后用胰酶消化5分钟后,离心去上清并重悬组织块,用含10%FBS的DMEM/F12培养基进行原代培养;分别再次尾静脉注射,经过3次转移后获得高转移细胞株,命名为MB49-LM1、MB49-LM2。所有细胞的使用都在十代以内。②获取高转移膀胱癌细胞株（MB49-LM）后,我们进行了相关的验证。我们用MB49和MB49-LM细胞同时尾静脉注射相同数量的细胞,每组12只鼠;两周后每组随机选取6只鼠,处死后观察肺部转移情况。通过肉眼图片及HE切片染色后观察可见高转移株转移灶数量明显增多;通过剩余鼠的生存曲线可见,高转移株致瘤后小鼠生存期明显缩短。通过上述实验,我们对高转移膀胱癌细胞株的转移能力进行验证。（2）高转移细胞通过EREG/EGFR信号通路促进膀胱癌转移的机制研究①为了确定细胞因子在高转移、低转移膀胱癌细胞中是否具有差异性表达,我们首先将两株高转移细胞和母细胞送检做qPCR分析。随后,抽取不同细胞RNA,并根据分析结果筛选出的基因,进行qPCR检测。最后根据两者结果初步确定相关性最强的细胞因子EREG。Array数据分析可见EREG是分泌因子中表达最高的;通过qPCR进一步检测证实EREG高表达。②MB49-P和MB49-LM细胞培养过程中,我们将收集细胞上清,即条件培养基（conditional media,CM）,用PBS作为对照。进一步通过ELISA检测高转移膀胱癌细胞株EREG自分泌明显增多;并通过WB实验发现EREG下游信号通路EGFR、STAT3、ERK1/2等在高转移细胞株中异常活化。③接下来,我们应用外源EREG蛋白刺激MB49细胞,观察其干性、侵袭能力改变情况并且进一步WB检测相关蛋白标志物的改变。④我们通过EREG中和抗体阻断EREG观察高转移细胞株干性、侵袭能力改变情况,进一步证明EREG可以通过激活膀胱癌细胞的p-EGFR来发挥功能。⑤证实了 EREG能够使膀胱癌细胞中p-EGFR水平升高后,我们应用EGFR抑制剂来阻断其下游效应,观察膀胱癌细胞迁移、侵袭能力改变。⑥体内应用EGFR抑制剂,观察其对小鼠肺转移的抑制情况。（3）miR-20b 调节EREG、EGFR 表达我们通过文献分析及TargetScan网站查询找到共同调控EREG、EGFR的miR-20b。首先,通过荧光素酶活性报告实验检测实验证实miR-20b可以打击EREG、EGFR的3’UTR、抑制蛋白合成;接下来通过在高转移细胞株中过表达miR-20b,小鼠体内实验证明miR-20b可以打击EREG、EGFR的3’UTR,抑制蛋白合成,从而抑制膀胱癌肺转移。（4）EREG、EGFR的表达的临床意义①接下来我们通过膀胱癌细胞的荷瘤实验中进一步验证EGFR的抑制剂吉非替尼（Gefitinib）对转移性膀胱癌的治疗作用。通过尾静脉肺转移模型,建立MB49-LM荷瘤鼠,随机分成两组,每组12只,采取口服给药方式（1mg/kg）,两周后每组随机处死6只小鼠观察肺部转移情况并统计分析;剩余小鼠用作生存分析。②鉴于我们机构样本库一直在收集膀胱癌患者治疗前的血液样本和相关预后信息,借助此平台,我们预先调取405例膀胱癌患者的血液本,分析膀胱癌患者中血清EREG水平与病人临床病理特点的联系,评估EREG预测膀胱癌发生、判断预后的可应用性。结果:我们首先建立膀胱癌高转移模型,并通过相关实验来证明高转移细胞株具有更强的干性、转移能力;其次,通过文献学习发现并验证肿瘤自身EGFR信号通路激活促进膀胱癌细胞干性、转移能力提高;我们通过基因Array分析、ELISA检测以及相关实验证实肿瘤细胞分泌的EREG是促进膀胱癌干性、转移能力的关键分子;接下来我们进一步在实验详尽阐述EREG/EGFR信号通路的分子机制;随后我们研究发现EREG、EGFR是miR-20b的靶基因并通过体内、体外实验证实;最后,我们将在体内探索应用EGFR抑制剂吉非替尼（Gefitinib）的抗肿瘤疗效,以及在405例膀胱癌患者中分析EREG在预测膀胱癌发生和指导预后方面的作用。结论:研究结果表明,通过尾静脉肺转移模型可以筛选出高转移膀胱癌细胞株。EREG/EGFR信号通路在提高肿瘤自身转移能力及促进肿瘤肺部定植起关键作用,并受miR-20b的调控。该EREG/EGFR信号通路为膀胱癌转移的关键靶点,能够提高自身肺部定植能力,从而加快膀胱癌肺转移;有望成为治疗转移性膀胱癌的治疗靶点。