一、目的意义胶质瘤作为一类常见的、多发的、对人类危害极大的恶性脑肿瘤,虽目前在手术、放疗、化疗等技术上已日渐完善,但病员仍具较高的伤残率和病死率。这主要是由于胶质瘤分化不全,呈浸润性生长,深入神经组织深处,导致手术难以全部将其切除,且胶质瘤细胞对放化疗有较强的耐受能力所致。目前临床上使用的常规放化疗手段在杀灭患者体内肿瘤细胞的同时,也严重损害了患者心、肝、肺、肾等重要脏器功能,且局部放疗和全身化疗对身体局部和整体免疫系统都有严重的破坏,大大影响了患者的生存质量。因此,在手术结合放化疗控制脑肿瘤生长及复发的同时,亟须探寻新的有效治疗方案。20世纪50年代,学术界开始提出了肿瘤干细胞(tumor stem cells,TSC)的概念,该学说认为,肿瘤之所以能够呈浸润性生长、并且能耐受高剂量的放化疗而容易复发,是因为肿瘤组织中存在着极少量充当干细胞角色的肿瘤细胞,这类细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,它们在肿瘤的形成和发展中起着至关重要的作用,因而很可能就是肿瘤生长、转移和复发的根源,这一少部分细胞即被称为肿瘤干细胞。1997年,Bonnet和Dick从白血病患者的肿瘤细胞中分离出少量具有致瘤性且能分化为其他肿瘤细胞的细胞,因其具有干细胞特征,从而证实了TSC的存在。之后,黑色素瘤等多种实体肿瘤中的干细胞样肿瘤细胞亦在其他多个领域的相关研究中得到相继证明。2004年,Singh等从胶质瘤中也分离出具有干细胞样特征的细胞,从而证明了胶质瘤中TSC的存在,并将其命名为“胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSC),其为脑肿瘤干细胞(brain tumor stem cells, BTSC)中的典型代表,位于胶质瘤细胞等级的最高点,是脑肿瘤发生发展的根源。因此,寻找靶向杀伤BTSC或GSC的方法途径、从而消除脑肿瘤并有效防止其复发,可为临床防治脑肿瘤提供有意义的借鉴依据。2015年的最新进展表明,肿瘤干细胞将成为肿瘤治疗最新策略的关注点。在各类研究热点中(包括对肿瘤干细胞的诱导分化、微波治疗、靶向其信号通路及微环境等),针对肿瘤干细胞的免疫治疗策略以其“安全性好、能在病员体内建立针对肿瘤干细胞的免疫监视和免疫记忆、达到对患者长期保护”的优势而备受关注。但目前为止,针对肿瘤干细胞的免疫治疗大多集中在对皮肤、肝脏、胃肠、肺恶性肿瘤治疗方面的研究,针对GSC靶向免疫治疗胶质瘤方面的工作尚需完善。一般说来,针对肿瘤的免疫治疗方法主要包括以下三种,即被动免疫治疗、过继免疫疗法和特异性主动免疫治疗。其中：(1)被动性免疫治疗主要即是指以单克隆抗体技术为基础的单克隆抗体及单克隆抗体偶联物的免疫导向治疗,是免疫治疗中较为成功的一种手段,自1997年以来已有多种单抗药物陆续获准上市；(2)肿瘤的过继免疫治疗是指将经过处理的自体或异体的免疫细胞或免疫分子(回)输给患者,以增强患者免疫功能的方法；(3)肿瘤的特异性主动免疫治疗又可按其针对的对象不同而分为肿瘤细胞疫苗、肿瘤抗原疫苗、亚细胞结构疫苗——exosome,以及以树突状细胞(dendritic cells,DC)为基础的肿瘤疫苗治疗。众所周知,DC是人体内作用最强的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC).未成熟DC具有活跃的摄取、处理抗原的能力,而成熟DC则是通过表达高水平的组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)-Ⅰ、Ⅱ类抗原和CD80、CD86等共刺激分子,有效地向T细胞呈递抗原从而激发机体的免疫应答反应。利用DC的这一重要功能,结合GSC在脑肿瘤中的根源性地位,提示我们：如若可以靶向杀伤GSC,则脑肿瘤的发生发展／复发就能够从根本上得到消除和抑制,而理论上,DC可以从GSC抗原呈递的角度来承担这种功效。如何以GSC为抗原,最大程度地使DC致敏、以完成对GSC的最佳靶向杀伤效力,是学术界关注的热点,也是本课题研究的重点问题之一。由于胶质瘤组织中肿瘤细胞异质性的存在,使得胶质瘤特异性抗原的纯化分离非常困难,学术界至今也尚无统一界定的GSC特异性抗原,因此,对宿主抗GSC的T细胞反应的激发就需要一系列的抗原决定簇,而不仅仅是局限于某一个或一小部分抗原决定簇。已知肿瘤细胞全抗原致敏树突状细胞的方式包括,使DC荷载肿瘤细胞裂解物、酸洗脱物、蛋白提取物或凋亡的肿瘤细胞,或是向DC中转染肿瘤细胞的全RNA,以及使DC与肿瘤细胞相融合等。各种方法中,肿瘤细胞的全RNA抗原致敏DC法具有可从较少的肿瘤(干)细胞中提取和扩增核酸产物的优点,但RNA性质较不稳定,容易在转染过程中降解；而本课题组前期工作已从事的肿瘤(干)细胞与DC融合疫苗方法提示,虽从理论上讲保留了DC呈递肿瘤抗原的生物学特性,但实际却发现,融合后的细胞活力略有降低,融合疫苗的吞噬能力亦较融合前略有降低；故提示,在进行“以GSC为抗原,最大程度使DC致敏、以完成对GSC的最佳靶向杀伤效力”的研究中,对RNA抗原致敏DC法及肿瘤(干)细胞-DC融合疫苗法的采用与否,应持慎重态度。对于DC荷载肿瘤细胞裂解物和凋亡肿瘤疫苗的DC致敏方法,曾有部分研究表明,该两类DC致敏法可以激发较强的针对肿瘤细胞的免疫应答,但其在胶质瘤干细胞-DC疫苗方面的研究和应用尚未见报道,特别是鲜见针对GSC-DC最佳致敏方法来从靶向杀伤的角度、与“脑肿瘤细胞-DC”对胶质瘤杀伤效果的比较研究。因此,本课题首先选取了几种不同的致敏DC方法(冻融裂解法,凋亡细胞法,全RNA提取法),以比较负载各种不同形式获取的GSC抗原后,DC成熟程度和功能(包括DC增殖、表面共刺激分子表达和免疫活性细胞因子分泌功能)的相应状态；之后,再筛选出最佳的DC致敏方式,用于后续靶向杀伤胶质瘤细胞,尤其是杀伤GSC的免疫治疗实验研究,期待能为免疫靶向杀伤GSC、提高胶质瘤治疗效果提供可借鉴实验依据。二、研究内容第一部分GSC的分离纯化及各种GC全抗原获取目的：有效获得分离纯化的GSC及提取各种GC全抗原,为后续实验研究奠基。方法：1、GSC的分离纯化：参考美国模式培养物集存库(American type culture collection,ATCC)的培养方法培养小鼠GL261胶质瘤细胞,接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中,25cm2塑料培养瓶中,置于37℃,5%CO2、饱和湿度恒温培养箱中培养。每1-2天传代一次。参照singh等人的无血清悬浮培养法培养小鼠GL261胶质瘤干细胞,于不含血清的DMEM/F12培养基中加入DMEM/F12、bFGF20ng/ml、EGF20ng/ml及1：50B27添加剂。将细胞接种于25cm2培养瓶中,置37℃,5%C02饱和湿度培养箱中培养,每3～4天加入含上述细胞因子的新鲜培养基,7～9天传代一次。传6代左右时以流式细胞术分选出CD133(肿瘤干细胞标志分子)表达阳性的细胞,并继续无血清培养扩增细胞。GL261胶质瘤细胞及GL261肿瘤球细胞经免疫荧光细胞化学和流式细胞术检测表面GFAP、CD133的表达,并进行GL261肿瘤干细胞球的分化试验,鉴定为胶质瘤细胞(GC)和胶质瘤干细胞(GSC)。2、GC全抗原的获取：分别以冻融裂解法、凋亡细胞法和全RNA提取法提取GC的全抗原,备以后续提呈给未成熟DC用。(1)冻融裂解法：收集在含血清培养基中呈贴壁生长的GL261细胞,1000转/分,离心5min,弃上清即去除原培养基,用不含酚红的RPMI1640培养基重悬、调整细胞密度至2×107/ml,40℃水浴30min,后置于-80℃冰箱中30min,再次37℃水浴30min以融解,如此反复,经过5个冻融周期后,2500rmp离心20min,取上清液,经0.22um针筒式滤器过滤,得到全细胞抗原悬液,以BCA法测得其蛋白浓度后将冻融抗原悬液置于-80℃保存备用。(2)凋亡细胞法：收集在含血清培养基中呈贴壁生长的GL261细胞,1000转/分,离心5min,弃上清即去除原培养基,加入用RPMI1640完全培养基(含10%胎牛血清的RPMI1640培养基)稀释为2mg/ml的替莫唑胺溶液,置于37℃,5%CO2、饱和湿度恒温培养箱中培养16h后,使用凯基生物的Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒对细胞行Annexin-FITC&PI双染法染色,行流式细胞术检测FITC和PI的荧光信号,并用流式细胞术分选FITC高表达的细胞,测得分选后的凋亡细胞纯度并置于RPMI1640完全培养基中4℃保存备用。(3)全RNA提取法：取处于对数生长期中的在含血清培养基中呈贴壁生长的GL261细胞,用RNA抽提试剂盒提取总RNA,并收集RNA溶液,经紫外分光光度计检测OD260/OD280,算得总RNA含量和纯度,于-80℃冻存备用。结果：实验中所用肿瘤细胞经anti-GFAP免疫荧光鉴定为小鼠GL261胶质瘤细胞系。通过无血清培养法结合流式细胞分选术,从小鼠的GL261胶质瘤细胞系中得到了较高纯度(CD133表达率80.5±5.2%)的GSC。通过对GC进行冻融裂解、诱导凋亡、提取全RNA等处理,得到了纯度、性质相对稳定的冻融裂解抗原(蛋白浓度1.9～2.1 mg/ml)、凋亡细胞抗原(纯度93.1±2.5%)和全RNA抗原(OD260/280:1.97～2.0)。结论：实验中所用肿瘤细胞经鉴定为小鼠GL261胶质瘤细胞系。通过无血清培养法结合流式分选,可从小鼠的GL261胶质瘤细胞系中得到较高纯度的GSC。通过对GC进行冻融裂解、诱导凋亡、提取全RNA等处理,可得到纯度、性质相对稳定的冻融裂解抗原、凋亡细胞抗原和全RNA抗原。第二部分 DC的诱导、培养、鉴定及最佳DC瘤苗的选择及制备目的：有效获得DC及“GC和/GSC抗原+DC”瘤苗,并选出最优致敏DC方式,用于后续免疫靶向GSC或GC治疗实验研究。方法：1、DC的诱导培养及鉴定：1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉C57小鼠后,将小鼠俯卧位固定于手术台。消毒后剪开皮肤,显露、分离并剔除小鼠双下肢肌肉组织,于髋关节和踝关节处剪断小鼠的股骨和胫腓骨并将其取出,保持无菌状态。用5mL灭菌注射器抽取5mL不含血清的RPMI-1640培养基。将针头分别从两端插入骨髓腔,反复冲洗,得到小鼠骨髓组织。收集冲洗液离心后先后加入红细胞裂解液对红细胞进行充分裂解,继而用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬于25cm2培养瓶,添加40ng/ml GM-CSF和40ng/mL IL-4,置于37℃C,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养。第3天换全液,去除悬浮细胞,继续培养至第5天时收集未成熟DC,经流式细胞术检测其表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达率,鉴定为未成熟DC。2、GC/GSC抗原+DC瘤苗的制备：给上述得到的小鼠骨髓源性未成熟DC分别负载以GC的冻融裂解抗原、凋亡抗原和全RNA抗原(分别对应第一部分中的三种GC全抗原提取方式),制成GC冻融裂解抗原+DC瘤苗、GC凋亡抗原+DC瘤苗和GC全RNA抗原+DC瘤苗。同时设立经脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激DC得到的LPS+DC疫苗为阳性对照组和未经刺激的DC为阴性对照组,CCK-8法测各组DC增殖情况,流式细胞术检测各组DC表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达率,ELISA测各组DC的免疫活性细胞因子TNF-α、IFN-β、IL-6、IL-10分泌量,以从中选出最佳致敏DC的方式,并以此最佳致敏方式制备GSC+DC瘤苗。结果：通过从同源的C57小鼠体内原代取材,得到了小鼠的骨髓细胞,以GM-CSF+IL-4诱导成为未成熟的树突状细胞。用所得的未成熟DC负载第一步中得到的三种GSC/GC全抗原及LPS,即可得到三种不同致敏方式的瘤苗和LPS+DC瘤苗(阳性对照)。阴性对照组DC不负载抗原,称为“对照组”负载各种抗原后,LPS组和凋亡组DC增殖显著高于冻融组及RNA组；冻融组、凋亡组和LPS组CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达率均显著高于RNA组(P<0.05),而冻融组、凋亡组和LPS组三组间无明显差异(P>0.05)；凋亡组TNF-α分泌量显著高于冻融组、RNA组和对照组(P<0.05)；冻融组和凋亡组IL-6分泌量显著高于对照组和RNA组(P<0.05)；各组IFN-γ分泌量无显著差异(P>0.05)；凋亡组IL-10分泌量显著低于冻融组、RNA组和LPS组(P<0.05)。结论：最优致敏DC方式为凋亡细胞法。该方式优势：抗原细胞量最小(即效率最高),使负载抗原后的DC高表达CD80、CD86和MHC-II,并使其所分泌的细胞因子量变化(免疫活性性因子TNF-α和IL-6升高,免疫抑制性因子IL-10降低)最明显。第三部分：同源T淋巴细胞的制备及体外T细胞杀伤实验目的：比较最佳致敏方式下的"GC+DC"瘤苗与"GSC+DC"瘤苗,于靶向杀伤胶质瘤细胞、胶质瘤干细胞实验中的疗效。方法：1、各种GC全抗原的获取同第一部分。2、DC诱导、培养、鉴定及最优致敏方式前提下的GSC+DC瘤苗和GC+DC瘤苗的制备同第二部分。3、同源T淋巴细胞的制备：采用小鼠的外周血淋巴细胞分离液、分离培养C57小鼠的淋巴细胞,用添加IL-2的含10%胎牛血清的RPMI1640培养基维持培养；经流式细胞仪检测其表面CD3分子的表达率后行磁珠分选,并于分选后再次检测其表面CD3分子的表达率,鉴定所得T淋巴细胞的纯度。4、体外T细胞杀伤实验：(1)以第一部分中培养的普通胶质瘤细胞株(GC)为靶细胞进行体外T淋巴细胞杀伤实验,分为单纯DC组、GC凋亡抗原+DC瘤苗组、GSC凋亡抗原+DC瘤苗组共3个组,效靶比(即经各组瘤苗刺激后的T细胞数与GC细胞数之比)20：1,行T淋巴细胞杀伤实验,并计算T淋巴细胞对普通胶质瘤细胞(GC)的杀伤率。(2)再以第一部分中分离提纯的GSC为靶细胞进行体外T淋巴细胞杀伤实验,同样分为单纯DC组、GC凋亡抗原+DC瘤苗组、GSC凋亡抗原+DC瘤苗组共3个组,分别与上述分离培养所得的同源T细胞混合培养,刺激激活T淋巴细胞,相应刺激后的3组T淋巴细胞再与分离提纯的同源胶质瘤干细胞(GSC)共培养,效靶比(即经各组瘤苗刺激后的T细胞数与GSC细胞数之比)20：1,行T淋巴细胞杀伤实验,并计算T淋巴细胞对胶质瘤干细胞(GSC)的杀伤率。用LDH法测定T淋巴细胞对GC或GSC的杀伤情况,计算结果,进行组间比较。在以GC作为T细胞杀伤的靶细胞时,方差分析显示差异有显著性意义(P<0.05)。5、统计学分析：全部数据采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,计量资料实验数据以“均数±标准差”(x±SD)表示,常规进行方差齐性检验、正态性检验。单变量两组资料之间的比较采用t检验,多组资料之间的比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异,有统计学意义。结果：从同源C57小鼠取材得到的小鼠外周血单个核细胞悬液,经磁珠分选、可获得高纯度的小鼠T淋巴细胞(CD3表达率90.3±1.7%)。各组激活的T淋巴细胞对GC的杀伤率确有不同；通过多重比较(SNK法)可知,经GC凋亡抗原+DC瘤苗组、GSC凋亡抗原+DC瘤苗组和LPS+DC瘤苗组刺激后T细胞对同源胶质瘤细胞的杀伤率显著高于单纯DC组(P<0.01)；而GC凋亡抗原+DC瘤苗组、GSC凋亡抗原+DC瘤苗组之间差异没有显著性意义(P=0.736)。而在以GSC作为T细胞杀伤的靶细胞时,方差分析显示各组间差异有显著性意义(P<0.05),提示各组激活的T淋巴细胞对GSC的杀伤率确有不同；通过多重比较(SNK法)可得,经GC凋亡抗原+DC瘤苗组、GSC凋亡抗原+DC瘤苗组和LPS+DC瘤苗组刺激后T细胞对同源胶质瘤细胞的杀伤率显著高于单纯DC组(P<0.01),且GSC凋亡抗原+DC瘤苗组刺激后T细胞对同源胶质瘤细胞的杀伤率显著亦高于GC凋亡抗原+DC瘤苗组(P<0.01)。结论：以凋亡细胞致敏法制备的GC+DC瘤苗和GSC+DC瘤苗,二者在体外T淋巴细胞杀伤实验中,当以同源胶质瘤细胞系(GC)为靶时,杀伤效果未见显著差异；但当以纯化的GSC为靶时,GSC+DC瘤苗杀伤效果显著优于GC+DC瘤苗。提示GSC+DC瘤苗对GSC有针对性杀伤作用。