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心血管疾病作为人类的第一大疾病,其高发病率及死亡率一直受到世界各国的关注。其生理病理的机制和治疗也一直是心血管领域的研究热点。目前,我国心血管病的发病率和死亡率逐年上升,已接近发达国家水平,严重影响着人民的健康状况,给国民经济带来不可估量的损失。但迄今为止,对心血管疾病的发病机制仍未十分明确。miRNAs（miRNAs）是一种大小约21—26个碱基的单链小分子、非编码RNA,具有高度进化保守性,并在翻译水平调节基因表达。他们广泛参与动植物生长发育、细胞分化、增殖与凋亡、激素分泌、肿瘤形成等各种过程。miRNA在心血管系统的发生、发育及心血管疾病的发生中也发挥了极其重要的作用。前期研究在构建成人正常心脏组织miRNA基因cDNA文库时发现,miR-126约占整个克隆总数的20%—23%,根据以往研究的结果,miRNA的克隆数目往往与该miRNA基因表达量呈正相关。我们由此认为miR-126是一个人类心脏高表达的miRNA。因此,拟选定该miRNA,对其功能进行深入研究。本课题拟从以下几个方面研究:首先我们拟在组织及细胞水平检测miR-126的表达谱,明确miR-126在不同组织细胞的表达水平;其次,拟在293细胞中初步研究miR-126与VEGF 3’-UTR的关系,通过外源表达miR-126和携带VEGF 3’-UTR的报告基因,通过检测报告基因,明确miR-126对靶基因表达的调节。再次,构建miR-126的慢病毒表达载体,并包装重组慢病毒颗粒,检测病毒梯度,建立miR-126过表达的稳转细胞株,利用分子生物学手段RPA、RT-PCR及Western blot明确上调miR-126表达对VEFG mRNA和蛋白表达的影响。另外,将表达miR-126的慢病毒感染内皮细胞及不同的肺癌细胞株在细胞水平检测miR-126对VEGF表达的影响,最后我们用稳转表达lv-mir-126的A549细胞株接种到裸鼠体内,在肿瘤动物模型体内确定miR-126对VEGF表达的调控作用。本研究的目的是检测miR-126的表达谱,比较其组织及细胞水平的表达差异,并初步探讨其高表达的作用。第一部分:miR-126的表达谱分析目的:分析miR-126在人体各组织及部分细胞的表达分布情况。方法:1、运用RNA酶保护法（RNA Protective Assay,RPA）检测:根据miR-126设计DNA片段（正义链）,并添加与mirVanaTM miRNA探针制备试剂盒中T7启动子3’末端匹配的序列,合成DNA片段,然后与T7启动子引物片段杂交,并使用Klenow DNA聚合酶补平,然后使用T7 RNA聚合酶转录32P标记的反义探针,加入DNaseⅠ消化DNA模板,使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离探针,洗脱、沉淀并且重悬RNA探针,用于RNA酶保护检测miR-126。2、运用RT-PCR方法检测:根据miR-126的序列设计其特异的颈环状逆转录引物及PCR扩增的前向及逆向引物,提取不同组织和细胞的RNA在反转录酶的作用下先行反转录获取cDNA,cDNA在特异酶及引物的作用下行PCR,并在PCR反应体系中加入荧光探针,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对miR-126进行定量分析。结果:RPA及RT-PCR结果均显示miR-126主要在人的心脏、肺脏及胃组织中高表达,在肾脏、大脑和骨骼肌中仅少量表达或无表达;在脐静脉内皮细胞中miR-126表达量明显高于其他细胞,而在hela细胞、293细胞、A549细胞及Y90细胞等肿瘤细胞中miR-126的表达量极低。结论:miR-126在人体各组织及细胞中表达有差异,其在心脏、肺及内皮细胞中高表达而在肿瘤细胞中表达量明显降低,提示miR-126可能参与这些组织细胞的病理生理过程。第二部分:MiR-126靶基因的预测及初步验证目的:通过生物信息学方法初步预测、并筛选出可能与心血管疾病密切相关的miRNA的靶基因,并通过荧光素酶报告基因系统确认miR-126对靶基因的作用。方法:运用miRanda、TargetScan、PicTar、MiRanda和BibiServ等靶基因预测软件检索mir-126可能的靶基因,筛选出保守程度高、结合自由能低,并且与心血管病理生理过程相关的基因做为候选靶基因,我们选定VEGF为研究的靶基因,然后构建萤火虫荧光素酶表达载体,在293细胞中验证miR-126与VEGF之间的关系。将包含VEGF的3’-UTR区克隆入pMIR-REPORTTM Luciferase vector（pLuc,Ambion）载体编码荧光素酶基因序列后,构建pLuc-VEGF/miR-126BS重组质粒。将pLuc-VEGF/miR-126BS重组质粒和pLV-miR-126表达质粒通过脂质体转染分方法转染293细胞,转染后48小时,收集细胞,然后进行荧光素酶检测。系统采用双荧光素酶检测系统,以海肾荧光素酶作为参照,检测细胞干预前后荧光素酶的变化趋势。同时采用点突变的方法使VEGF-3’UTR中miR-126的结合位点发生碱基突变,检测其抑制作用是否消失。结果:（1）通过不同的的预测软件我们发现多种miR-126的可能靶基因,我们选定在心血管病理生理过程中发挥重要作用的VEGF作为我们研究的靶基因。（2）在293细胞中共转染pLV-miR-126,可以抑制pLuc-VEGF/miR-126BS载体表达荧光素酶,而当3’-UTR进行突变修饰后,miR-126不能够抑制其表达。结论:生物学信息学预测VEGF可能是miR-126的靶基因,miR-126通过作用于VEGF的3’UTR端而起到抑制基因表达的作用。第三部分:miR-126慢病毒生产目的:构建miR-126的慢病毒表达载体,包装生产重组慢病毒,慢病毒滴度、活性测定。方法:根据miR-126序列信息设计PCR引物,两端分别添加酶切位点和保护碱基。从A549细胞中提取人基因组DNA,以基因组DNA为模板,使用设计的引物进行PCR扩增,得到499bp的目的条带,切胶回收PCR产物,然后双酶切消化,琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。表达载体质粒(pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPTM)也进行双酶切消化,电泳后切胶回收。连接目的片段和表达载体,连接产物转化感受态菌株DH5a,涂布平板,过夜培养,使用PCR的方法进行阳性菌落鉴定。接种阳性菌落于LB培养基,摇床过夜培养,提取质粒,然后使用载体多克隆位点上游的引物进行测序。分析测序结果,选择测序正确的重组质粒,摇床扩增其对应的转化菌株,使用去内毒素质粒抽提试剂盒进行无内毒素质粒DNA的提取。复苏293TN细胞,经过两三次传代培养,调整细胞至适合转染状态。接种细胞至10cm细胞培养皿。使用脂质体转染的方法进行共转染实验,即将miR-126慢病毒表达载体以及慢病毒包装质粒混合物（Lentivirus Package plasmid mix）共转染293TN细胞。使用慢病毒表达载体上携带的绿色荧光基因copGFP作为荧光标记物,观察转染效率。转染后24小时,荧光显微镜下观察转染效率,并且对细胞进行换液处理。转染后48小时,收取细胞上清液,使用0.45um的微孔膜过滤去掉细胞碎片,冰浴保存。使用梯度稀释法测定病毒滴度。结果:（1）成功调取miR-126基因序列,构建miR-126的慢病毒表达载体。（2）成功进行了LV-miR-126重组病毒的生产和滴度测定。（3）慢病毒感染293细胞后,能够大大增强目的基因的表达。结论:通过慢病毒途径可以有效增强miR-126在宿主细胞中的表达。第四部分:在内皮细胞中分析miR-126与VEGF表达之间的关系目的:在内皮细胞中分析miR-126与VEGF表达之间的调控关系方法:（1）使用LV-miR-126慢病毒颗粒感染内皮细胞,感染后72小时,收集细胞,然后分别提取总RNA和总蛋白,通过RPA和West Blot的方法观察miR-126与VEGF之间的关系。（2）使用慢病毒LV-miR-126和对照LV-GFP感染内皮细胞,感染后72小时,取200μl细胞传代到96孔板中,分别孵育24,48,72个小时,然后加入10μl MMT试剂,再孵育4小时,去除上清液,加入DMSO溶解,然后在酶标仪上检测OD570,并使用OD630作为参照。结果:（1）在内皮细胞高表达miR-126,VEGF的表达水平明显减低。（2）使用慢病毒感染内皮细胞后,细胞可以高表达miR-126,但其增殖受到抑制。结论:在内皮细胞中过表达miR-126,可以抑制VEGF表达,并且抑制内皮细胞增殖。推测miR-126可能通过调节VEGF参与了内皮相关疾病的病理生理过程。第五部分:动物模型分析miR-126与VEGF表达之间的关系目的:采用活体动物模型,分析miR-126与VEGF表达之间的关系方法:（1）在肺癌细胞株A549、Y-90和SPC-A1中研究过表达miR-126对VEGF及细胞周期的影响（2）使用慢病毒LV-miR-126和对照LV-GFP感染上述三种肺癌细胞株,感染后48小时,收集细胞,然后使用70%乙醇固定1小时,然后用PI染色,进行流式细胞仪检测细胞周期。（3）使用Lv-miR-126和LV-GFP感染A549细胞,摸索适合细胞感染的最佳MOI值。根据最佳MOI值,进行A549细胞的病毒感染实验。感染后每隔24小时进行观察,待绿色荧光蛋白表达稳定后,使用有限稀释法进行单细胞克隆的筛选。得到细胞克隆之后,通过RT-PCR和West Blot的方法对细胞克隆进行性能检测。（4）使用稳定的A549/LV-miR-126和A549/LV-GFP接种到裸鼠体内,每只小鼠在左前足腋下接种2*106细胞。在25天后,处死小鼠,剪下肿瘤,然后称重,确定miR-126过表达后对体内肿瘤模型VEGF的抑制作用。结果:（1）在肺癌细胞株A549、Y-90和SPC-A1高表达miR-126,可抑制VEGF的表达及抑制细胞增殖。（2）在肺癌细胞株A549、Y-90和SPC-A1使用慢病毒感染高表达miR-126,提高了处在G1期的细胞的比例,而S期细胞的比例则发生减少。（3）LV-miR-126稳定转染的A549细胞株在裸鼠模型中的所形成的肿瘤重量明显低于对照细胞所成肿瘤。结论:在肺癌细胞中过表达miR-126,可以抑制VEGF表达,并且通过调节细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖。并且在动物体内进一步证实miR-126对VEGF表达的抑制作用。