研究背景神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）是起源于神经外胚层的原始神经嵴细胞的原始肿瘤,是继白血病、脑瘤和恶性淋巴瘤之后居于第四位的儿童肿瘤,占所有儿童恶性肿瘤的8%-10%。国外报道80%病例诊断时年龄小于5岁,偶见于年龄较大的儿童及成人,也有报道90%以上的患儿发病年龄在10岁以前。约75%的原发瘤位于腹部,主要是肾上腺部位,亦可见于腹腔交感神经节、纵隔、盆腔或颈部。神经母细胞瘤在临床上具有多样性,既可耐受多种化疗而呈恶性进展过程,也可自然消退或分化为良性的神经节细胞。其复发和转移是患儿死亡的主要原因之一。肿瘤转移是恶性肿瘤中普遍存在的现象,也是治疗失败和患者死亡的主要原因。肿瘤转移是癌细胞与宿主细胞相互作用的连续复杂过程。这个复杂的过程是由一系列基因调控系统所组成。近年来,肿瘤分子生物学的研究重点逐渐转入分离和克隆肿瘤转移基因与转移抑制基因,并对这些基因的调控因子和转移过程中的作用机制进行深入研究,期望通过揭示肿瘤转移在基因水平的本质,为改进肿瘤的诊断方法和治疗手段提供依据。Astrocyte elevated gene-1（AEG-1）是2002年首次克隆出来的新基因。AEG-1的发现源于人类免疫缺陷病毒-1（human immunodeficiency virus-1,HIV-1）感染,人们研究发现HIV-1感染可以通过改变一组基因的表达而使得谷氨酸运载体数量减少从而影响中枢神经系统的功能导致神经退行性变和HIV-1相关性痴呆（HIV-1-associated dementia,HAD）等中枢神经系统功能障碍,在这一组基因中发现AEG-1是一个新的基因。AEG-1基因由12个外显子和11个内含子组成,位于8q22,该区域也是人类胶质瘤的高度相关地带。AEG-1 cDNA的全长为3611bp,包括多聚A尾,开放阅读框架从220到1986碱基,编码的蛋白由582氨基酸组成,分子量为64kDa,等电点为9.33。近年来对AEG-1展开了深入的研究,发现AEG-1不仅能促进神经退行性变的发生,还能促进肿瘤的进展和转移。尽管对AEG-1在细胞内的功能、机制及生物学功能还不完全清楚,最近的研究强烈支持AEG-1是促进肿瘤进展的一个关键因子。AEG-1在多种体外培养的肿瘤细胞如:乳腺癌、多形性胶质细胞瘤、前列腺癌及黑色素瘤和肿瘤组织标本中是高表达的。AEG-1的过表达能增加肿瘤细胞的转移和侵袭,基因沉默AEG-1能降低人肿瘤细胞的转移和侵袭。AEG-1是Ha-ras信号途径的下游基因,Ha-ras激活可以增加细胞的克隆形成,而AEG-1基因沉默能显著抑制Ha-ras激活导致的效应。AEG-1的异位过表达还导致NF-κB反应的粘附分子（ICAM-2,ICAM-3,选择素E,选择素L,选择素P配体）,TLR4（toll-likereceptor）,TLR5和IL-8等的细胞因子上调,解释了AEG-1增加乳腺癌的肺转移和永生化的黑素细胞对肺上皮细胞粘附的机制。但是,其在神经母细胞瘤中的表达情况还不清楚,同时,还没有任何研究把侧重点放在AEG-1与临床病理参数的关系及其能否成为预测肿瘤预后的指标上,因此本课题不仅研究AEG-1在神经母细胞瘤中的表达情况,同时研究AEG-1与临床特征的关系及其对病人预后的影响。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指双链RNA（dsRNA）进入细胞后特异性阻断与其同源的基因表达的现象。它是当前研究基因功能的重要工具,而且已有人将其应用于肿瘤、病毒感染基因治疗的研究中。用慢病毒（Lentivirus）做载体介导RNAi用于基因治疗的研究更有实际应用潜力,因为与其它病毒载体系统相比,慢病毒能转导非分裂（Non-dividing）细胞并将shRNA表达结构整合到宿主细胞基因组,实现目的基因的稳定沉默。我们假设用RNA干扰技术破坏AEG-1mRNA,使AEG-1蛋白的合成处在极低的水平,降低AEG-1蛋白及对下游基因的转录调控,能够在很大程度上阻断肿瘤细胞的AEG-1的表达,抑制AEG-1促进肿瘤增殖和转移的效应,提高神经母细胞瘤的治疗效果。在本研究中,首先深入了解AEG-1在神经母细胞瘤中的表达情况,以及其与神经母细胞瘤的临床病理参数及预后的关系;在此基础上采用慢病毒介导RNAi的方式建立AEG-1基因稳定沉默的神经母细胞瘤细胞株,证明其AEG-1基因沉默的效果;通过与其亲本细胞的比较,观察阻断AEG-1蛋白对细胞增殖、细胞周期、凋亡、侵袭和化疗敏感性的影响,分析AEG-1在肿瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭和化疗敏感性中所起的作用,为临床应用奠定基础,也为其它实体肿瘤解决类似问题起到借鉴作用。第一部分AEG-1在神经母细胞瘤中的表达及其对预后的影响1.目的（1）检测AEG-1在神经母细胞瘤中的表达（2）研究AEG-1的表达与神经母细胞瘤临床病理参数的关系及其对预后的影响（3）明确AEG-1在神经母细胞瘤细胞中的定位2.材料与方法（1）收集病例资料:收集山东大学齐鲁医院接受手术并病理证实的神经母细胞瘤标本32例,详细记录病人的资料,并进行随访。（2）研究AEG-1在神经母细胞瘤组织的表达:免疫组织化学法。（3）明确AEG-1在神经母细胞瘤细胞中的定位:免疫荧光标记法。3.结果（1）AEG-1在神经母细胞瘤组织中是高表达的,75%（24/32例）标本为阳性表达。（2）对32例神经母细胞瘤患者的临床资料进行x²检验,研究AEG-1与临床病理参数之间的关系。年龄<1岁的患者中AEG-1阳性率为37.5%（3/8）,年龄≥1岁患者中AEG-1阳性率为87.5%（21/24）,二者相比有显著性差异（P=0.012）,年龄≥1岁组AEG-1表达水平高于年龄<1岁组;男性患者中AEG-1阳性率为77.8%（14/18）,女性患者中AEG-1阳性率为71.4%（10/14）,二组无显著性差异（P=0.703）;原发部位为肾上腺的患者中AEG-1阳性率为78.9%（13/19）,发病部位为肾上腺以外的患者中AEG-1阳性率为69.2%（11/13）,二组无显著性差异（P=0.420）;处于疾病早期（Early stage）（Ⅰ+Ⅱ+Ⅳs）的患者中AEG-1阳性率为50% （5/10）,处于进展期（Advanced stage）（Ⅲ+Ⅳ）患者中AEG-1阳性率为90%（18/20）,二组相比有显著性差异（P=0.03）,进展期AEG-1表达水平高于早期;根据国际神经母细胞瘤病理分型,组织结构良好型（Favourable histology,FH）的患者中AEG-1阳性率为58.8%（10/17）,组织结构不良型（Unfavourable histology,UFH）患者中AEG-1阳性率为93.3%（14/15）,二组相比有显著性差异（P=0.041）,UFH患者AEG-1表达水平高于FH。（3）Spearman相关性分析,AEG-1表达与患者的发病年龄（r=0.404, P=0.022）、临床分期（r=0.447,P=0.010）、病理分型（r=0.389,P=0.024）呈正相关。（4）对32例神经母细胞瘤患者进行单因素Kaplan-Meier分析,再用Log-rank检验两组生存率的统计意义,研究与神经母细胞瘤预后相关的因素。AEG-1阳性表达的患者五年生存率为17.7%与阴性表达患者的生存率62.5%之间有显著性差异（P=0.031）,AEG-1阳性表达的患者术后生存率明显低于阴性;发病年龄<1岁的患者五年生存率为45.8%与≥1岁的患者生存率17.1%之间有显著性差异（P=0.020）,发病年龄≥1岁的病人术后生存率明显低于发病年龄<1岁的患者;男性患者五年生存率为26.5%,女性患者五年生存率为33.3%,不同性别患者生存率之间没有显著性差异（P=0.902）;原发于肾上腺的患者五年生存率为19.2%与原发于肾上腺以外的的患者生存率27.5%之间没有显著性差异（P=0.242）;处于疾病早期（Ⅰ+Ⅱ+Ⅳs）的患者的五年生存率69.4%与进展期（Ⅲ+Ⅳ）的患者生存率13.8%之间有显著性差异（P=0.015）,进展期（Ⅲ+Ⅳ）的病人的术后生存率明显低于早期（Ⅰ+Ⅱ+Ⅳs）的患者;国际神经母细胞瘤病理分型中FH的患者的五年生存率45.7%与UFH的患者生存率15.6%之间有显著性差异（P=0.003）,UFH的病人的术后生存率明显低于FH的患者。（5）Cox多因素分析结果,国际神经母细胞瘤病理分型是影响神经母细胞瘤病人预后的独立因素（P=0.022）;AEG-1的表达（P=0.176）,年龄（P=0.247）,临床分期（P=0.694）不是影响神经母细胞瘤病人预后的独立因素。（6）AEG-1在神经母细胞瘤的细胞浆和细胞膜表达,在细胞核内没有AEG-1的表达。4.结论（1）AEG-1在神经母细胞瘤组织中是高表达的,75%（24/32例）标本为阳性表达。（2）AEG-1的表达在不同的发病年龄、临床分期、病理类型的患者之间有显著性差异,而在不同的性别、不同发病部位的患者之间没有显著性差异。（3）Spearman相关性分析,AEG-1表达与患者的发病年龄、临床分期、病理分型呈正相关。（4）对32例神经母细胞瘤患者进行单因素Kaplan-Meier分析,再用Log-rank检验两组生存率的统计意义。AEG-1的表达、病人的发病年龄、临床分期和病理分型对患者预后的影响具有统计学意义,而病人的性别和起病的部位对患者的预后没有影响。（5）Cox多因素分析结果,病理分型是影响神经母细胞瘤病人预后的独立因素。（6）AEG-1在神经母细胞瘤的细胞浆和细胞膜表达,在细胞核内没有AEG-1的表达。第二部分慢病毒介导的神经母细胞瘤细胞AEG-1基因沉默1.目的（1）构建AEG-1 RNA干扰慢病毒载体（2）筛选AEG-1基因沉默的细胞株（3）比较AEG-1基因沉默的效果2.材料与方法（1）AEG-1 RNA干扰慢病毒载体的构建:采用Invitrogen公司的BLOCK-iT Lentiviral RNAi Expression System,构建入门克隆和病毒包装目的质粒。（2）RNA干扰慢病毒的生产和滴度测定:四种质粒共转染293FT的方式生产病毒,病毒功能滴度测定用转导试验,分子滴度测定用定量PCR技术。（3）基因沉默细胞株的筛选:慢病毒转导M17和SK-N-SH细胞后用Blasticidin筛选,建立AEG-1基因沉默细胞株和对照细胞株。（4）细胞瞬时转染实验:用Lipofectamine2000进行转染试验,评价RNAi效果。（5）AEG-1 mRNA表达水平的分析:定量RT-PCR。（6）AEG-1蛋白表达水平的检测:Western Blot分析。3.结果（1）成功构建AEG-1RNAi入门质粒,两个针对不同序列的RNAi质粒均有显著的干扰效果,AEG-1mRNA抑制效果分别达53.7%和61.1%。（2）包装产生的浓度为2×10¹⁰copies/ml的Lenti6-AEG-1和Lenti6-NS转导M17、SK-N-SH细胞的功能滴度分别为:1.8×10⁶TU/ml、1.2×10⁶TU/ml和1.7×10⁶TU/ml、1.2×10⁶TU/ml。（3）成功筛选出AEG-1基因沉默的M17/AEG-1（-）和SK-N-SH/AEG-1（-）细胞,同时建立非特异性对照细胞M17/NS和SK-N-SH/NS。（4）M17/AEG-1（-）和SK-N-SH/AEG-1（-）的AEG-1mRNA水平约下降80%, M17/NS和SK-N-SH/NS的AEG-1mRNA水平与亲本细胞相比无明显改变;M17/AEG-1（-）和SK-N-SH/AEG-1（-）的AEG-1蛋白质水平约下降90%。4.结论（1）成功构建AEG-1 shRNA表达质粒,并比较针对不同靶序列的RNAi质粒的效果,确定RNAi效果较好的靶序列。（2）采用BLOCK-iT慢病毒RNA干扰系统,成功构建并包装生产较高滴度的慢病毒载体。（3）应用病毒转导加Blasticidin筛选的方式,成功建立AEG-1基因稳定沉默的M17和SK-N-SH细胞及非特异性病毒转导细胞。（4）定量RT-PCR和Western Blot分析结果表明筛选细胞AEG-1基因mRNA水平显著抑制,蛋白质水平明显下降。第三部分AEG-1基因沉默对神经母细胞瘤的生物学行为的影响1.目的（1）观察AEG-1基因沉默对细胞增殖的影响（2）分析AEG-1基因沉默对细胞周期的影响（3）探讨AEG-1基因沉默对凋亡的影响（4）研究AEG-1基因沉默对肿瘤细胞侵袭的影响（5）分析AEG-1基因沉默对细胞化疗敏感性的影响’2.材料与方法（1）细胞增殖实验:采用MTT法和克隆形成实验评价AEG-1基因沉默对细胞增殖的影响。（2）细胞周期分析:用流式细胞技术测定细胞DNA含量,Modtif软件分析细胞周期。（3）细胞凋亡实验:采用Annexin-V和PI双染流式细胞仪分析AEG-1基因沉默对细胞的凋亡情况的影响。（4）细胞侵袭能力实验:Transwell侵袭试验。（5）化疗敏感性实验:MTT法测定细胞对化疗药物敏感性的差异。3.结果（1）AEG-1基因沉默细胞增殖分别降低45.1%,57.4%,明显慢于亲本细胞,克隆形成率分别降低43.5%,56.7%;非特异性对照转染的细胞增殖未受明显影响。（2）AEG-1基因沉默细胞G0/G1期细胞增加29.3%,26.9%,与亲本细胞相比有显著性差异。（3）AEG-1基因沉默细胞的凋亡率增加7.5%和6.4%。（4）AEG-1基因沉默的细胞穿过膜的能力降低56.8%,50.0%,明显低于亲本细胞和对照细胞（P<0.01）（5）AEG-1基因沉默细胞对化疗药物的敏感性明显增加。4.结论（1）AEG-1能促进神经母细胞瘤细胞增殖和抑制凋亡。（2）AEG-1基因沉默可以通过将细胞阻滞在G0/G1期,抑制细胞增殖。（3）AEG-1能促进肿瘤细胞的侵袭。（4）AEG-1基因沉默可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。