H9N2禽流感病毒主要在亚洲、中东和北非等地区流行。作为低致病性流感病毒,H9N2感染主要引起家禽呼吸困难及产蛋下降等症状。但是当与其它病原共感染时,H9N2可导致高发病率与死亡率,对养禽业造成巨大经济损失。H9N2不仅感染家禽,而且能感染多种哺乳动物包括人、猪、猫及狗等。此外,研究发现H9N2还为高致病性H7N9与H5Nx以及H10N8等流感病毒提供内部基因,能够通过天然重组产生具有潜在大流行的新型流感病毒。这些证明H9N2不仅制约养禽业健康发展,而且还潜在地对公共卫生安全具有威胁。虽然H9N2疫苗的广泛使用能有效的控制疫情进一步恶化,但近年来国内越来越多的H9N2毒株被分离于H9N2疫苗免疫鸡群。H9N2免疫逃逸株的不断出现表明,国内H9N2流行毒株的抗原性正在不断变异。因此,鉴定H9N2主要抗原蛋白HA中的关键抗原位点、评估其对病毒的作用对于H9N2流行分子监测和有效疫苗设计至关重要。本研究利用抗H9N2的HA特异性单克隆抗体通过免疫逃逸株筛选,鉴定出7个关键B细胞抗原表位,且发现HA中的N166D单突变可改变H9N2的抗原性和致病性。1.H9N2禽流感病毒免疫逃逸株的筛选与鉴定为筛选与鉴定H9N2免疫逃逸株,利用4株课题组已鉴定的抗HA蛋白特异性单克隆抗体（3F2,2G10,7F4及5C7）,与当前分离毒株XZ299进行鸡胚中和试验。经过两次筛选共得到4株单克隆抗体逃逸株,分别命名为m3F2,m2G10-1,m2G10-2及m5C7。对抗体逃逸株的HA序列测定分析发现这些逃逸株的HA中有7个氨基酸位点突变,分别为 Q133L,N166D,N167K,A168L,D207N,N218D 及 L234M。其中Q133L和N218D突变为首次报道。这7个突变位点都位于HA头部表面,且部分位于受体结合区域附近。值得注意的是,与野生型H9N2比较,逃逸株变体m3F2的HA仅有N166D单一突变,提示该位点可能影响H9N2抗原性和致病性。这些免疫逃逸株的获得及抗原相关关键氨基酸突变的鉴定,丰富了 H9N2主要抗原蛋白HA中B细胞表位,为进一步解析国内H9N2流行毒株分子抗原变异规律及高效疫苗研制打下了基础。2.表达HA_N166D突变的重组H9病毒构建与拯救为了进一步探究逃逸株变体m3F2的HA蛋白中N166D突变是否影响H9N2抗原性和致病性,本研究首先以XZ299毒株的RNA为模板反转录成cDNA,PCR扩增出野生型HA基因,并利用重组酶一步法克隆到pDP2002载体构建流感病毒HA₁66N拯救质粒。以HA₁66N为模板,通过Over-lap PCR技术构建突变型流感病毒HA₁66D拯救质粒。随即在MDCK以及293T细胞的共培养细胞中分别共转染7个PR8流感病毒拯救质粒（PB1,PB2,PA,NP,NA,MP,NS）以及HA₁66N或HA₁66D进行病毒拯救。拯救病毒经鸡胚扩增,序列测序验证后分别命名为rgPR8-H9 166N和rgPR8-H9166D病毒,病毒滴度分别达1.58×107以及2.32×106。HI试验进一步表明拯救病毒rgPR8-H9 166D与逃逸株m3F2一样不被单抗3F2有效识别。以上重组病毒rgPR8-H9166N和rgPR8-H9 166D拯救为进一步研究N166D突变对H9N2病毒致病性的影响提供了材料。3.HA_N166D突变对H9N2抗原性及致病性影响为了研究HA_N166D突变对H9N2禽流感病毒致病性的影响,在本研究比较测定了重组病毒rgPR8-H9 166N与rgPR8-H9 166D,野生型XZ299与免疫逃逸株m3F2的体外病毒生长曲线及体内动物感染试验。体外生长特性结果表明N166D不显著影响病毒在MDCK细胞中的复制。小鼠感染结果证明,与感染rgPR8-H9 166D的小鼠比较,感染rgPR8-H9 166N的小鼠体重明显减轻,且肺内病毒滴度更高。SPF鸡感染结果表明,尽管鸡喉部和泄殖腔中的排毒没有明显差异,但是野生毒株XZ299和突变体m3F2感染鸡的血清HI试验证明N166D突变可导致鸡体内抗HA特异性抗体反应性下降。以上结果表明,HA蛋白中N166D突变不仅影响H9N2的抗原性,而且影响H9N2的致病性。因此,监测国内H9N2禽流感病毒临床分离毒株中HA蛋白N166D突变对预防免疫逃逸,高效疫苗更新创制具有重要意义。