研究背景：淋巴管是肺癌最常见的转移途径之一,有无淋巴结转移是影响肺癌治疗预后的重要因素之一。目前抗淋巴管生成是目前肿瘤治疗新的方向,已经明确肿瘤相关淋巴管的形成是肿瘤细胞淋巴转移的必须途径,但肿瘤新生淋巴管的形成和淋巴结转移机制尚不十分清楚。有研究采用动物模型,通过阻断血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)-3信号可抑制淋巴管生成,或通过中和趋化因子(如SLC/CCL21)可抑制癌细胞的淋巴结转移,提示肿瘤淋巴管生成和肿瘤细胞淋巴管、淋巴结转移并非经过单一途径,还可能与肿瘤血管生成一样涉及多种调节机制,揭示肿瘤细胞转移前淋巴管形成机制有助于提出新的抗肿瘤转移策略。1)内皮祖细胞与淋巴管生成新生成的淋巴管与肿瘤通过淋巴结转移和患者的预后关系密切。过去普遍认为淋巴管不存在于肿瘤组织内,但是肿瘤通过淋巴管转移又无从解释,近期的研究发现肿瘤组织及其肿瘤组织的周围存在淋巴管,它们成集束状或分散存在,它们的密度要高于正常的组织,Mandri ota等在动物实验也证实了淋巴管可以存在于实体瘤内。内皮细胞的前体细胞是内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs).1997年,Asahara等首先分离出CD34+/VEGFR-3+血管EPCs,这些EPCs来源于人体的外周血中,这些细胞可以分化为血管内皮细胞。等到人出生后,血管EPCs主要位于骨髓,只有在病理状态下,如血管损伤、组织缺血和肿瘤发生等,血管EPCs通过细胞因子的诱导,从骨髓动员到外周血循环中,使局部组织的血管再生。2003年,Salyen等从胎肝分离出CD34+/CDl33+ /VEGFR-3+细胞,该群细胞可以分化为淋巴管内皮细胞或血管内皮细胞。2005年,Wang等从脐带血分离出表达CD34+/CD133+/VEGFR-3+标志的EPCs,用VEGF-C将其诱导分化为淋巴管内皮细胞,故将CD34+/CD133+/VEGFR-3+EPCs命名为淋巴管内皮祖细胞(1ymphatic endothelial progenitor cells,LEPCs),以此与血管EPCs相区分,研究表明LEPCs参与体内淋巴管新生如肾移植后。有数据表明外周血中VEGFR-3+LEPCs强阳性的非小细胞肺癌患者预后较差,可能与其更早发生淋巴管、淋巴结微转移相关。2)SDF-1/CXCR4与淋巴管生成近年来,人们越来越关注趋化因子受体(CXC chemokine receptor-4,CXCR4)及其配体基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)相互作用形成的反应轴SDF-1/CXCR4在肿瘤侵袭和转移中的作用,认为肿瘤组织中新生的血管与其诱导相关,对肿瘤血管生成具有调节作用。在对乳腺癌的研究中发现SDF-1/CXCR4反应轴可能与肿瘤侵袭和转移有关。2001年Muller等人发现,趋化因子受体CXCR4和CCR7高表达于乳腺癌细胞系、乳腺癌原发灶及转移灶中,其配体SDF-1和CCL21在常见的转移部位如淋巴结、肺、肝脏和骨髓等也存在高水平表达现象,CXCR高表达是早期乳腺癌远处复发的高危因素。越来越多的研究显示多种包括非小细胞肺癌在内的多种实体肿瘤组织中CXCR4均有着过量的表达,非小细胞肺癌中CXCR4表达的差异与其转移潜能密切相判,最近的研究发现SDF-1/CXCR4激活ERK信号系统进而活化IKK和NF-kB信号转到通路进而增加MMM-9表达,促进肺癌细胞的迁移。目前认为SDF-1/CXCR4反应轴在介导诱发肿瘤细胞侵袭反应中主要与血管新生相关,癌细胞通过大量的克隆增殖,侵入局部组织,在血管内皮生长因子的作用下,诱导产生新的血管,并且CXCR4在新生血管表面高表达,然后癌细胞在原发病灶脱离,穿过新生血管壁进入体循环,CD34阳性细胞在富含SDF-1器官的血管壁中捕获癌细胞,癌细胞至此由癌组织转移到至正常组织。随后的研究发现,CXCR表达与肿瘤淋巴结转移存在相关性,Kato等对79例手术切除的乳腺浸润性导管癌组织分析得知,有淋巴结转移的乳腺癌也存在CXCR4局灶性高表达的现象,Tanabe等在动物实验中也发现,在有淋巴管浸润的猫的乳腺癌组织中与CXCR4mRNA表达水平存在正相关,但使用CXCR4拮抗剂T140或通过反义RNA干扰技术均可抑制乳腺癌细胞在体外的迁移反应。由于新生血管和新生淋巴管都有相同的前体祖细胞,既然SDF-1/CXCR能调控新生血管的形成,那么SDF-1/CXCR轴在肺癌淋巴管新生中到底有怎样的作用呢?3) VEGF-C/VEGFR-3与肺癌淋巴管转移VEGF-C是目前发现的最具特异性的淋巴管内皮生长刺激因子,是VEGF家族中的一员,其特异性的受体是VEGFR-3,与淋巴管上皮有很高的化学亲和性,可以诱导淋巴上皮增殖和淋巴窦新生,明显表达于淋巴管丰富的区域。在非小细胞肺癌患者中,有淋巴结转移组中淋巴液中VEGF-C水平较无淋巴结转移者显著升高,肺癌组织中VEGF-C/VEGFR-3表达的强度与肺癌淋巴管、淋巴结转移存在明显相关性。VEGF-C作为纪体与VEGFR-3结合,可使受体磷酸化,从而发挥酪氨酸激酶活性,淋巴管内皮细胞在MEK/ERK和PI3/AKT途径的刺激下进行有丝分裂,促进淋巴管生成,起到淋巴管生成因子的作用。如果SDF-1/CXCR活化能刺激肺癌组织淋巴管的新生,其作用是否与促进LEPCs表达VEGF-C相关?4) CCBE1以及VEGF-C和淋巴管转移有实验证实,CCBE1对于VEGF-C的激活起着至关重要的作用。在啮齿类动物胚胎时期诱导CCBE1突变,验证得知,动物的主要淋巴管道无法形成,即使是从主静脉分化形成淋巴管的Prox1+中也无法形成淋巴管道,此实验说明,VEGF-C/VEGFR-3通路激活淋巴系统在CCBE1突变前才能实现。因此,CCBE1在胚胎时期通过诱导VEGF-C使其激活,进而促进机体的淋巴管生成。然而,有实验证实,CCBE1对于淋巴管的生成作用不大,其主要是通过激活VEGF-C/VEGFR-3通路,从而对淋巴管的生成起作用。所以,CCBE1对于淋巴管的生成是充分但不必要的条件。目的：1.通过收取的人体肺癌组织及正常组织进行对比,通过检测两组中CCBE1的表达以及淋巴管的特异抗体LYVE-1的表达,确认LYVE-1在两种组织之间的表达情况,进而明确CCBE1与LYVE-1之间的关系；2.将制作的三组慢病毒分别导入到小鼠肺癌细胞中,经过在细胞中稳定表达后,通过嘌呤霉素筛选,杀死未导入病毒的小鼠肺癌细胞,紧接着将筛选的细胞培养待用；3.将筛选好的小鼠肺癌细胞进行western blot筛选,筛选出抑制效果最好的-组病毒株,预备待用；4.将处理好的小鼠肺癌细胞和没有处理的小鼠肺癌细胞导入C57小鼠内,待小鼠成瘤后检测两组中VEGF-C的表达量,得出两者之间的关系。方法：1.采用Q-PCR技术检测CCBE1在正常组织和肺癌组织中的表达情况；接着运用免疫组化跟western blot技术检测正常组织跟肺癌组织中CCBE1以及LYVE-1的表达水平。2.在无菌条件下培养小鼠肺癌细胞,待到稳定培养3代左右进行病毒转染,并在荧光显微镜下观察导入细胞的状态,进而运用嘌呤霉素筛选；3.将筛选出来的三组含有病毒处理的细胞进行western blot处理,根据western blot结果选取抑制效果最明显的一组,将抑制效果最好的一组跟未经处理的小鼠肺癌细胞导入分好组的成年雄鼠体内,待到成瘤后,处死小鼠,完整切取肿瘤组织行western blot处理,观察两组组织中VEGF-C的表达情况。结果：1. CCBE1在肺癌中的表达及其与LYVE-1的关系在Q-PCR中,两组数据存在明显的差异,在正常组织中,CCBE1的表达要高于肺癌组织,尤其是在有淋巴结转移的组织中,CCBE1的表达更低,可见,CCBE1在肺癌组织中为低表达；在免疫组化和western blot实验中,两种组织中,CCBE1在正常组织中的表达量要高于肺癌组织中,此结果跟Q-PCR的结果相吻合,但是对于淋巴管的特异标记抗体—— LYVE-1来说,其表达水平跟CCBE1正好相反,在肺癌组织中表达要高于正常的肺组织,在有淋巴结转移的组织中表达更高,此结果表明,CCBE1跟LYVE-1的表达存在负相关。2.病毒导入小鼠肺癌细胞将事先准备好的小鼠肺癌细胞放于温箱内培养,将病毒连同polybrene按照一定的比例配制完善,导入小鼠肺癌细胞,并在荧光显微镜观察,随着时间的推移,慢病毒导入细胞数量增多,在显微镜视野中的荧光细胞数目不断增多。3.小鼠肺癌细胞的筛选将配制好的嘌呤霉素营养液替代原来小鼠肺癌细胞的培养液,未导入病毒的小鼠肺癌细胞杀死。漂浮于培养液表面,12小时后换用无嘌呤霉素的培养液,待细胞生长到整个生长瓶的80%左右,进行第二次嘌呤霉素筛选。4.筛选抑制效果最好的经过处理的小鼠肺癌细胞通过对导入病毒的三组小鼠肺癌细胞进行western blot试验,结果显示,ShRNA2的抑制效果最好,另两组的也有一定的抑制作用,但抑制效果不如ShRNA2,按照实验结果,ShRNA2被认为是抑制效果最好的一组。5.将抑制效果最好的一组导入小鼠体内及结果分析待细胞成瘤以后,完整切除肿瘤组织,通过western blot试验检测两组中VEGF-C的表达情况,抑制组的表达量要高于未经处理的小鼠肺癌细胞。结论：1.正常的肺组织中CCBE1的表达要高于肺癌组织,尤其在有淋巴结转移的肺癌组织中表达更低；LYVE-1的表达正好相反,在肺癌中的表达要高于正常肺组织,有淋巴结转移组织中表达更高。2.经过病毒处理,小鼠肺癌细胞内的CCBE1表达量较未经处理的细胞表达更低。3. CCBE1表达的是一种保护性的蛋白,能够抑制VEGF-C的蛋白分泌,从而能够抑制淋巴管的生成。