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研究背景:肝脏是对电离辐射敏感的器官,放射性肝损伤（Radiation-induced liver damage,RILD）是原发性肝癌、胃肠消化道肿瘤等上腹部肿瘤放射治疗,或异体骨髓或造血干细胞移植准备过程中常见的剂量限制毒性反应和并发症,然而其发生分子机制迄今仍未被阐明。脂质代谢紊乱在多种生理、病理过程中发挥重要调控作用,尽管有研究表明脂质代谢紊乱可能与放射性肝损伤密切相关,但其在电离辐射诱导的肝脏损伤的发生与发展中的具体作用及分子机理尚不明确。研究目的:本研究旨在探讨辐射诱导的脂质代谢稳态变化与肝损伤发生发展的相关性,明确其在放射性肝损伤发生与发展中的生物学作用,并阐明所涉及的分子调控机理。研究方法:（1）明确辐射诱导的脂代谢异常与放射性肝损伤的相关性:采用X-RAD SmART小动物放射治疗模拟定位机建立小鼠RILD模型;通过血生化分析仪、苏木精-伊红染色、免疫组化染色、蛋白免疫印迹和透射电镜技术检测辐射对小鼠的肝损伤水平;采用油红O染色及甘油三酯（Triglycerides,TG）和游离胆固醇（free cholesterol,FC）检测试剂盒明确电离辐射对肝脏脂质代谢稳态的影响。（2）单细胞测序技术结合功能验证初步确定可能的调控机制:采用X-RAD SmART小动物放射治疗模拟定位机建立RILD小鼠模型,通过10× Genomics单细胞转录组测序技术分析电离辐射对肝脏细胞分群及特定细胞群内差异表达基因的影响,经生物信息学分析初步筛选放射性肝损伤小鼠肝脏不同细胞群中与脂代谢有关的差异基因富集的信号通路,并采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）法在肝组织中进行验证。构建辐射诱导的脂代谢关键调控基因PPARα敲除小鼠模型并进行基因型的鉴定,通过两步肝灌注法提取小鼠原代肝实质细胞,经免疫荧光染色鉴定后,随后采用流式细胞术和免疫荧光染色检测PPARα对辐射后肝实质细胞周期阻滞和DNA损伤情况的影响。此外,通过X-RADSmART小动物放射治疗模拟定位机建立PPARα基因敲除小鼠的放射性肝损伤模型,通过血生化分析仪和苏木精-伊红染色法等检测肝脏受照后小鼠损伤相关情况的变化。（3）辐射诱导的脂代谢异常调控放射性肝损伤发生发展的分子机制研究:通过丙二醛（Malonaldehyde,MDA）和铁含量测定试剂盒检测辐射前后不同基因型小鼠肝组织中MDA和铁含量水平,采用蛋白免疫印迹检测辐射后肝组织中COX2蛋白的表达变化,普鲁士蓝染色观察辐射对肝实质细胞内铁沉积情况的影响。另外,通过MDA测定试剂盒和蛋白免疫印迹检测KO-PPARα后受辐射小鼠肝组织内MDA和COX2蛋白的含量。构建辐射诱导的脂代谢关键调控基因FABP1敲除小鼠模型并进行基因型的鉴定,通过两步肝灌注法提取各基因型小鼠原代肝实质细胞,采用信号通路研究经典策略,通过qRT-PCR法和蛋白免疫印迹检测辐射对调控通路关键效应分子mRNA和蛋白表达水平的影响;利用String数据库（https://cn.string-db.org/）预测调控通路关键分子之间的靶向互作关系,随后分别经蛋白免疫印迹和双荧光素酶报告基因系统进行验证;在体外水平分别通过油红O染色、C11 BODIPY581/591染色和普鲁士蓝染色以及MDA检测试剂盒和DCFH-DA活性氧荧光探针研究PPARα-FABP1-SCD1调控通路各个关键基因对辐射后肝实质细胞内脂质沉积、膜脂质过氧化水平和铁离子沉积的影响。（4）初步探讨靶向辐射诱导的脂代谢异常相关机制的干预策略:采用C57BL/6J小鼠构建放射性肝损伤小鼠模型,经腹腔注射激动剂WY14643激活小鼠肝内PPARα的表达,并通过蛋白免疫印迹法进行验证;分别采用血生化分析、苏木精-伊红染色、MDA和铁含量检测、蛋白免疫印迹和qRT-PCR法,检测靶向激活PPARα对电离辐射诱导的肝损伤发生与发展的防护作用。研究结果:（1）明确辐射诱导的脂代谢异常与放射性肝损伤的相关性:采用单次30 Gy全肝精准X射线照射成功建立小鼠放射性肝损伤模型,可见照后1天与未受照射小鼠相比,辐射即可导致小鼠血清中肝功能指标ALT与AST水平显著升高（p＜0.05）;照后2周肝组织病理损伤严重,DNA双链断裂增加,线粒体膜断裂、嵴线模糊,表明辐射导致肝组织严重受损。此外,辐射诱导肝组织内脂滴扩大、数目增多,脂质沉积明显,TG（p＜0.01）和FC含量显著增加,提示辐射导致小鼠肝脂质代谢紊乱,增加肝内脂质含量水平。（2）单细胞测序技术结合功能验证初步确定可能的调控机制:10×Genomics单细胞转录组测序技术对肝脏经30 Gy单次X射线照射后2 w的C57BL/6J小鼠肝组织进行分析发现,肝内细胞群的分类并未发生显著改变,但辐射可诱导特定细胞群内相关基因发生差异表达,其中肝实质细胞内差异基因变化更加显著,差异基因共计有307种,其中294种表达上调,13种表达下调;对差异基因进行KEGG分析,发现差异基因主要富集于PPAR、铁死亡、脂肪酸降解等与脂代谢调控有关的信号通路。经qRT-PCR法验证了受照后肝组织中脂代谢关键调控基因PPARα的表达显著增高。采用PPARα基因敲除小鼠进行研究发现,敲除PPARα可导致肝细胞中辐射诱导的DNA双链断裂（p＜0.05）和细胞G2/M期阻滞水平增加（p＜0.001）,体内实验表明敲除PPARα可引起肝脏受照小鼠血清中ALT（p＜0.01）与AST（p＜0.05）的含量增加,肝组织病理损伤加重。（3）辐射诱导的脂代谢异常调控放射性肝损伤发生发展的分子机制研究:辐射诱导肝组织中MDA含量（p＜0.01）、铁含量（p＜0.0001）以及COX2蛋白表达增加,促进肝实质细胞内铁沉积,诱导肝铁死亡。KO-PPARα则导致受辐射小鼠肝内的MDA含量（p＜0.001）和COX2蛋白含量较对照组增加。辐射诱导肝内FABP1、SCD1在mRNA水平和蛋白水平表达升高,且二者表达均受PPARα的调控,String数据库分析发现三者之间具有潜在靶向关系,其中PPARα可通过与FABP1的启动子区结合调控FABP1的表达,FABP1则通过蛋白互作的方式影响SCD1的表达,且PPARα对SCD1表达的调控并非完全依赖于FABP1。体外研究发现分别下调PPARα、FABP1和SCD1的表达均可导致肝实质细胞内脂质沉积,膜脂质过氧化水平升高以及铁离子含量增加,初步揭示PPARα-FABP1-SCD1轴可调控肝铁死亡影响RILD的发生与进展。（4）初步探讨靶向辐射诱导的脂代谢异常相关机制的干预策略:持续10天低剂量（100 mg/kg/d）腹腔注射激动剂WY14643的策略可有效激活小鼠肝内PPARα的表达（p＜0.05）,降低辐射诱导的小鼠血清中ALT（p＜0.05）水平的升高,改善辐射引发的肝组织病理学损伤。激动剂WY14643可稳定辐射后肝内脂质氧化水平和铁代谢平衡,降低辐射诱导的肝铁死亡水平,具体表现为:WY14643干预显著抑制辐射诱导的肝内COX2蛋白的表达（p＜0.05）,降低辐射后肝内脂质过氧化物MDA含量,抑制辐射导致的转铁蛋白FPN的降低（p＜0.05）,减少肝内的铁含量（p＜0.01）。研究结论:本研究证实了辐射诱导的脂质代谢异常与放射性肝损伤的发生发展有关,其涉及的作用机制与PPARα-FABP1-SCD1作用轴影响肝内脂质氧化水平和铁代谢,进而调控铁死亡有关。