葛根是一种经典的常用中药,具有解肌发表、升阳透疹、生津止渴的功效。现代研究发现,葛根含有异黄酮类、葛根苷类、三萜皂苷类、生物碱及其他化合物等,葛根素是葛根的主要有效成分之一,属于葛根异黄酮类化合物,葛根的解热、降糖作用历史悠久,近年来很多研究表明葛根素与葛根均有明显的解热、降糖作用,然而,亟待解决的问题是葛根素是否与葛根的解热和降糖作用相关,葛根素对葛根解热与降糖作用的贡献有多大?目前对葛根素与葛根的研究仅限于对葛根素单体或者葛根整体的研究,而这种研究结果往往不能反映葛根整体中葛根素的功效,由于葛根是包含葛根素在内的多成分复杂的有机整体,单独研究葛根素单体化合物的作用势必会忽略葛根中其它成分对葛根素的影响。迄今为止,国内外葛根素与葛根整体降糖、解热作用相关性的研究仍为空白,葛根素在葛根解热或降糖作用的贡献度还没有得到深入研究和系统阐述。因此,对葛根素与葛根解热与降糖作用的相关性研究,并根据葛根素与葛根的量效关系进一步确定葛根中葛根素药效的贡献度,不仅为葛根中葛根素质量、药效的可靠性和安全性提供实验依据,而且为临床糖尿病和炎性发热的治疗提供理论依据。本研究采用免疫亲和层析柱实现葛根提取液中葛根素的敲除与富集,进而阐述葛根素对葛根整体药效的贡献度。免疫亲和层析柱是利用抗原抗体特异性结合的原理,将样品中的目标成分特异性敲除,获得原样原液基本不变的阴性样品,还具有特异性强、产出量高等优点。本实验运用免疫亲和层析柱大量特异性敲除葛根中的葛根素,以进一步探索葛根素与葛根药效作用的相关性及量效关系。第一部分不同葛根素含量的葛根提取液对发热小鼠体温和TNF-a含量的影响目的：通过比较分析不同含量的不同含量葛根素的葛根提取液对小鼠体温及血清、下丘脑、海马中TNF-α的干预作用,揭示葛根素对葛根解热功效的贡献度。方法：用皮下注射干酵母的方法制备小鼠的发热模型,将小鼠随机分成PUE-100%(葛根提取液,以此葛根提取液中葛根素的含量100%为基准)组、PUE-10%(敲除葛根素的葛根提取液,此提取液含10%葛根素)组、PUE-50%(敲除50%葛根素的葛根提取液,此提取液含50%葛根素)组、PUE-200%(敲入100%葛根素的葛根提取液,此提取液含200%葛根素)组、PUE(葛根素)组、Aspirin (阿司匹林)组、生理盐水组、发热模型组,1h后给小鼠灌胃,分别在1、2、3、4、5、6h检测小鼠直肠温度的变化,并在给药3h后取血、下丘脑、海马,检测炎症因子TNF-α的表达值。结果：1不同葛根素含量的葛根提取液对发热小鼠体温的影响随着时间推移,葛根提取液敲入葛根素对体温的影响大体呈现先降低后升高的趋势,尤其以给药后3h体温下降最明显,PUE-50%、PUE-100%、PUE-200%组的体温变化值(△T)分别为-0.71±0.15、-0.92±0.19、-1.23±0.21℃,明显低于PUE-10%组(-0.26±0.20℃),体温的变化趋势为PUE-200%<PUE-100%<PUE-50%<PUE-10%,说明在给药后3h,葛根提取液敲入葛根素的含量越高,对干酵母致热小鼠的解热效果越明显。2不同葛根素含量的葛根提取液对发热小鼠血清、下丘脑、海马和TNF-α含量的影响TNF-a在小鼠血清中的含量极少甚至低至不能测出,而在海马、下丘脑中分布较多。在下丘脑中,模型组小鼠TNF-α含量均明显高于对照组,其高达1400.22±363.11pg·mL-1,与模型组相比,PUE-10%、PUE-50%、PUE-100%、PUE-200%组的TNF-α含量明显下降。TNF-α-在下丘脑中的分布趋势是PUE-10%>PUE-50%> PUE-100%>PUE-200%,与PUE-10%组相比,PUE-50%、PUE-100%组的小鼠下丘脑中TNF-α含量减少,且PUE-200%组含量下降最明显。葛根提取液中不同的葛根素含量(X)与TNF-α表达值(Y)线性相关分析结果显示,葛根提取液敲入葛根素含量越高,对下丘脑中炎症因子TNF-α含量的抑制作用越强。TNF-a在海马中的分布趋势是PUE-50%>PUE-100%>PUE-200%>PUE-10%,与PUE-10%组相比,PUE-50%、PUE-100%和PUE-200%组中的TNF-α含量反而升高,显示出海马中TNF-α含量并未随葛根中敲入葛根素含量的增多而呈现明显规律。结论：葛根素与葛根的解热作用具有明显的相关性,葛根提取液敲除葛根素后的解热作用明显降低,表明随着葛根中葛根素含量的增加,其解热效应明显增强。第二部分不同葛根素含量的葛根提取液对HUVECs细胞增殖及TM、vWF、PAI-1、 T-PA、SOD表达的影响目的：考察葛根提取液中0.36、3.6、36mg·mL-1三种不同葛根浓度和10%、50%、100%、150%四种不同的葛根素含量的葛根提取液对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤模型的降糖相关因子][M、vWF、PAI-1、T-PA、SOD表达值的影响,揭示葛根素与葛根降糖功效相关性及量效关系。方法：以体外高糖培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)建立内皮细胞损伤模型,根据孵育细胞的培养液不同进行分组,将细胞随机分成PUE-100%组、PUE-10%组、PUE-50%组(药物制备同第一部分)、PUE-150%(敲入50%葛根素的葛根提取液,此提取液含150%葛根素)组的0.36、3.6、36mg-mL-1三种不同的葛根浓度组、空白组、模型组、格列齐特组(6.46、0.65、0.07mg·mL-1的三组不同浓度组)、PUE组,分别在24h和48h用MTT分析法测定细胞的活性值,并检测细胞上清液中降糖相关因子vWF、TM、T-PA、PAI-1、SOD的表达值。结果：1不同葛根素含量的葛根提取液对HUVECs细胞增殖和vWF、TM、T-PA、PAI-1、SOD表达值的影响1.1不同葛根素含量的葛根提取液对HUVECs细胞增殖的影响给药24h,葛根浓度在0.36、3.6mg·mL-1时,随着葛根提取液敲入葛根素含量的增加,促进HUVECs细胞增殖的效果增强；给药48h,葛根浓度在036mg·mL-1时,随着葛根提取液敲入葛根素含量的增加,促进细胞增殖效果先增强后减弱,以PUE-100%组效果最佳,OD490值达2.31±0.87。1.2不同葛根素含量的葛根提取液对]HUVECs上清液中PAI-1表达的影响给药24h,葛根浓度为3.6mg·mL-1时,PUE-100%、PUE-150%组含PAI-1为2.98±0.32、2.48±0.53ng·mL-1,与 PUE-50%(4.42±0.01 ng·mL-1)和 PUE-10%(5.44±0.07 ng·mL-1组的PAI-1表达值相比均显著降低(P<0.05),说明给药24 h,随着葛根提取液敲入葛根素含量的增加,拮抗细胞上清液中PAI-1表达升高的效果越明显；给药48h,PUE-100%(1.39±0.39 ng·mL-1)、PUE-150%(1.55±0.62 ng·mL-1)组的PAI-1表达值,较PUE-10%(4.62±0.09 ng·mL-1)、PUE-50%(3.1±0.26 ng·mL-1)组明显降低(P<0.05),说明给药48 h,随着葛根提取液敲入葛根素含量的增加,拮抗细胞上清液中PAI-1表达升高的效果先增强后减弱,并以PUE-100%组最好。1.3不同葛根素含量的葛根提取液对HUVECs上清液中TP-A表达的影响给药24h,葛根浓度在036mg·mL-1时, PUE-50%<PUE-100%、PUE-150%,1各组T-PA的表达值分别为6.35±0.11、6.49±0.1、6.46±0.1ng-mL-1,与PUE-10%组相比明显降低(P<0.05),表明随着葛根提取液敲入葛根素含量的增加,促进T-PA的表达先升高后降低,并以PUE-100%组最强； 葛根浓度在 3.6mg·mL-1时PUE-50%<PUE-100%<PUE-150%,含T-PA分别为5.35±0.24、5.56±0.2、6.03±0.14 ng·mL-1,PUE-150%组与PUE-10%组相比较明显升高(P<0.05),表明随着葛根提取液敲入葛根素含量的增加,促进T-PA的表达明显增强。不同葛根素含量的葛根提取液对HUVECs上清液中M、vWF、SOD的表达影响不明显。2葛根提取液不同的葛根浓度对HUVECs细胞增殖和vWF、TM、T-PA、PAI-1、SOD表达值的影响除PUE-10%组外,随着各组药物葛根浓度逐渐降低,给药24h和48h,促进细胞的增殖、拮抗PAI-1、促进T-PA的表达效果较好；PUE-100%组在葛根浓度为0.36、3.6、36mg·mL-1时TM值分别为1.00±0.01、0.62±0.04、0.17±005ng·mL-1,可见PUE-100%组TM值随着葛根浓度升高而明显下降,PUE-100%组HUVECs细胞上清液中TM的表达效果增强,其余各给药组TM的表达变化不明显；细胞上清液中vWF、SOD的表达未呈现明显的变化规律。3细胞培养时间对HUVECs细胞增殖和vWF、TM、T-PA、PAI-1、SOD表达值的影响随着细胞培养时间延长,各给药组的MTT值及UVECs细胞上清液SOD值均明显降低,TM的分泌明显下降,甚至低至不能测出,说明24h较48h各给药组促进活细胞增殖和细胞上清液中SOD、TM分泌的效果更明显；而细胞上清中vWF、PAI-1、T-PA表达值的变化均不明显。结论：葛根素和葛根的降糖作用有一定的关联性,并与不同含量的葛根素的含量、葛根的浓度有关。