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目的
1.观察人支气管上皮（BEAS-2b）细胞在呼吸道合胞病毒(RSV)感染及姜黄素衍生物（H33L42H3）干预后黏蛋白5ac(Muc5ac)mRNA、蛋白及白细胞介素33（IL-33）蛋白水平的变化，探讨RSV感染后及姜黄素衍生物对气道黏液分泌的调控作用及机制。
2.观察Notch通路γ-分泌酶特异性抑制剂（DAPT）阻断对RSV感染及姜黄素衍生物干预后BEAS-2b细胞Notch1、Jagged1、Muc5acmRNA表达、蛋白水平及IL-33蛋白水平的变化，探讨Notch信号通路在RSV感染气道粘液高分泌的作用机制及姜黄素衍生物的干预效应。
3.为临床应用姜黄素衍生物治疗RSV感染引起的气道黏液高分泌提供实验依据，为RSV感染治疗药物的研发提供新思路。
方法
1.将BEAS-2b细胞传代培养，待细胞生长至80%-90%左右时，于96孔板中配制100μL的BEAS-2b细胞悬液,培养板预培养24h(在37℃，5%CO2),向培养板加入10μL的10-50μmol/L的H33L42H3、DATP及0.1%DMSO。将培养板分别孵育12h、24h,向每孔加入10μLCCK-8溶液。在培养箱内孵育1-4h后，用酶标仪测定450nm吸光度。
2.建立RSV感染的体外BEAS-2b细胞模型，将BEAS-2b细胞传代培养，待细胞生长至80%-90%左右时，按每孔2*105传代于六孔板中，随机分成5组：A组（H33L42H3+RSV组）、B组（DAPT+H33L42H3+RSV组）、C组（DAPT+RSV组）、D组（RSV对照组）和E组（DMSO细胞对照组）。RSV感染BEAS-2b细胞造模前0.5h，A组予H33L42H3（10μmol/L）预处理，B组在H33L42H3预处理前先以DAPT（20μmol/L）预处理1h。A-E组以100TCID50RSV感染吸附BEAS-2b细胞2h后加维持液继续培养，各组分别培养至12h、24h收获细胞及上清液进行检测。
3.实时荧光定量（RT-PCR）检测上述2个时间点各组Notch1、Jagged1、Muc5acmRNA表达情况。
4.WesternBlot法检测Notch1、Jagged1、Muc5ac蛋白水平。
5.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养上清液中IL-33蛋白。
结果
1.病毒滴度测定：
本实验RSV的TCID50为10-4.6/50μl，病毒攻击量为100TCID50。即10-2.6/50μl。
2.H33L42H3、DAPT及0.1%DMSO的细胞毒性：
10μmol/LH33L42H3、20μmol/LDAPT及0.1%DMSO处理后两个时间点（12h、24h）BEAS-2b细胞存活率分别99.0%、98.8%；99.6%、98.6%和99.6%、98.8%与细胞对照组相比差异无统计学意义（均P＞0.05），表明上述浓度的药物对BEAS-2b细胞无毒性作用。
3.H33L42H3、DAPT干预后RSV感染的细胞病变：
感染RSV后，BEAS-2b细胞出现细胞病变效应（CPE），形态凌乱，皱缩成团，甚至漂浮，并出现大量异常颗粒，有明显的合胞体形成。E组未见CPE现象；D组CPE现象最为严重，且与12h相比，24hCPE现象更为显著，而与D组相比，A、B、C组RSV感染的CPE现象较为不明显，B组尤为不明显，且与12h相比，24hCPE现象更不明显，呈时间依赖性，表明H33L42H3可通过Notch信号通路提高细胞存活率。
4.RSV感染及H33L42H3、DAPT干预后Notch1mRNA表达及蛋白水平变化：
E组Notch1mRNA表达量和蛋白表达量最少，与E组相比，D组mRNA表达量和蛋白水平在RSV感染后12h、24h两个时间点均显著增加（均P＜0.05），其中24h增加更为明显；与D组相比，两个时间点A组、B组、C组Notch1mRNA表达量及蛋白水平均有所减少（均P＜0.05），以B组表达量减少最明显（均P＜0.01）；而A组与C组相比，同一时间点表达量相近，差异无统计学意义。
5.RSV感染及H33L42H3、DAPT干预后Jagged1mRNA表达及蛋白水平变化：
E组Jagged1mRNA及蛋白水平仅少量表达，与E组相比，D组mRNA表达量及蛋白水平在RSV感染后12h、24h两个时间点均增加显著（均P＜0.05），24h增加更显著；与D组相比，两个时间点的A组、B组、C组表达量均有减少（均P＜0.05），而B组Jagged1mRNA及蛋白表达量降低最显著（均P＜0.01）；A组与C组相比，同一时间点表达量相近，差异无统计学意义。
6.RSV感染及H33L42H3、DAPT干预后Muc5acmRNA表达及蛋白水平变化：
E组Muc5acmRNA及蛋白水平均呈低表达，在感染RSV12h、24h后，与D组相比，A组、B组、C组表达量均有降低（均P＜0.05），其中B组表达量最低（均P＜0.01）；A组与C组相比，同一时间点表达量相近，差异无统计学意义。与E组相比，D组Muc5acmRNA及蛋白水平表达量明显升高（均P＜0.05）。
7.RSV感染及H33L42H3、DAPT干预后IL-33蛋白水平变化：
E组IL-33蛋白水平呈低水平，与D组相比，感染RSV后两个时间点12h和24hA组、B组、C组蛋白水平均明显减少（均P＜0.05），其中B组蛋白水平最低（均P＜0.01），A组与C组相比，同一时间点表达量相近，差异无统计学意义。与E组相比，D组表达量明显增高（均P＜0.05）。
结论：
1.RSV感染后Muc5ac蛋白表达增加，表明RSV感染可引起气道黏液高分泌；同时Notch1、Jagged1、IL-33表达增加，表明Notch1信号通路通过介导IL-33的释放参与RSV感染后气道黏液高分泌过程。
2.H33L42H3下调Notch1、Jagged1、IL-33的表达，通过抑制Notch1信号传导通路介导的IL-33的释放，同时，DAPT干预后可抑制RSV感染后Notch1信号通路的激活，与H33L42H3具有相同效应，进一步证实H33L42H3可通过抑制Notch1信号传导通路介导的IL-33的释放，参与调控RSV感染气道黏液高分泌过程。
1.观察人支气管上皮（BEAS-2b）细胞在呼吸道合胞病毒(RSV)感染及姜黄素衍生物（H33L42H3）干预后黏蛋白5ac(Muc5ac)mRNA、蛋白及白细胞介素33（IL-33）蛋白水平的变化，探讨RSV感染后及姜黄素衍生物对气道黏液分泌的调控作用及机制。
2.观察Notch通路γ-分泌酶特异性抑制剂（DAPT）阻断对RSV感染及姜黄素衍生物干预后BEAS-2b细胞Notch1、Jagged1、Muc5acmRNA表达、蛋白水平及IL-33蛋白水平的变化，探讨Notch信号通路在RSV感染气道粘液高分泌的作用机制及姜黄素衍生物的干预效应。
3.为临床应用姜黄素衍生物治疗RSV感染引起的气道黏液高分泌提供实验依据，为RSV感染治疗药物的研发提供新思路。
方法
1.将BEAS-2b细胞传代培养，待细胞生长至80%-90%左右时，于96孔板中配制100μL的BEAS-2b细胞悬液,培养板预培养24h(在37℃，5%CO2),向培养板加入10μL的10-50μmol/L的H33L42H3、DATP及0.1%DMSO。将培养板分别孵育12h、24h,向每孔加入10μLCCK-8溶液。在培养箱内孵育1-4h后，用酶标仪测定450nm吸光度。
2.建立RSV感染的体外BEAS-2b细胞模型，将BEAS-2b细胞传代培养，待细胞生长至80%-90%左右时，按每孔2*105传代于六孔板中，随机分成5组：A组（H33L42H3+RSV组）、B组（DAPT+H33L42H3+RSV组）、C组（DAPT+RSV组）、D组（RSV对照组）和E组（DMSO细胞对照组）。RSV感染BEAS-2b细胞造模前0.5h，A组予H33L42H3（10μmol/L）预处理，B组在H33L42H3预处理前先以DAPT（20μmol/L）预处理1h。A-E组以100TCID50RSV感染吸附BEAS-2b细胞2h后加维持液继续培养，各组分别培养至12h、24h收获细胞及上清液进行检测。
3.实时荧光定量（RT-PCR）检测上述2个时间点各组Notch1、Jagged1、Muc5acmRNA表达情况。
4.WesternBlot法检测Notch1、Jagged1、Muc5ac蛋白水平。
5.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养上清液中IL-33蛋白。
结果
1.病毒滴度测定：
本实验RSV的TCID50为10-4.6/50μl，病毒攻击量为100TCID50。即10-2.6/50μl。
2.H33L42H3、DAPT及0.1%DMSO的细胞毒性：
10μmol/LH33L42H3、20μmol/LDAPT及0.1%DMSO处理后两个时间点（12h、24h）BEAS-2b细胞存活率分别99.0%、98.8%；99.6%、98.6%和99.6%、98.8%与细胞对照组相比差异无统计学意义（均P＞0.05），表明上述浓度的药物对BEAS-2b细胞无毒性作用。
3.H33L42H3、DAPT干预后RSV感染的细胞病变：
感染RSV后，BEAS-2b细胞出现细胞病变效应（CPE），形态凌乱，皱缩成团，甚至漂浮，并出现大量异常颗粒，有明显的合胞体形成。E组未见CPE现象；D组CPE现象最为严重，且与12h相比，24hCPE现象更为显著，而与D组相比，A、B、C组RSV感染的CPE现象较为不明显，B组尤为不明显，且与12h相比，24hCPE现象更不明显，呈时间依赖性，表明H33L42H3可通过Notch信号通路提高细胞存活率。
4.RSV感染及H33L42H3、DAPT干预后Notch1mRNA表达及蛋白水平变化：
E组Notch1mRNA表达量和蛋白表达量最少，与E组相比，D组mRNA表达量和蛋白水平在RSV感染后12h、24h两个时间点均显著增加（均P＜0.05），其中24h增加更为明显；与D组相比，两个时间点A组、B组、C组Notch1mRNA表达量及蛋白水平均有所减少（均P＜0.05），以B组表达量减少最明显（均P＜0.01）；而A组与C组相比，同一时间点表达量相近，差异无统计学意义。
5.RSV感染及H33L42H3、DAPT干预后Jagged1mRNA表达及蛋白水平变化：
E组Jagged1mRNA及蛋白水平仅少量表达，与E组相比，D组mRNA表达量及蛋白水平在RSV感染后12h、24h两个时间点均增加显著（均P＜0.05），24h增加更显著；与D组相比，两个时间点的A组、B组、C组表达量均有减少（均P＜0.05），而B组Jagged1mRNA及蛋白表达量降低最显著（均P＜0.01）；A组与C组相比，同一时间点表达量相近，差异无统计学意义。
6.RSV感染及H33L42H3、DAPT干预后Muc5acmRNA表达及蛋白水平变化：
E组Muc5acmRNA及蛋白水平均呈低表达，在感染RSV12h、24h后，与D组相比，A组、B组、C组表达量均有降低（均P＜0.05），其中B组表达量最低（均P＜0.01）；A组与C组相比，同一时间点表达量相近，差异无统计学意义。与E组相比，D组Muc5acmRNA及蛋白水平表达量明显升高（均P＜0.05）。
7.RSV感染及H33L42H3、DAPT干预后IL-33蛋白水平变化：
E组IL-33蛋白水平呈低水平，与D组相比，感染RSV后两个时间点12h和24hA组、B组、C组蛋白水平均明显减少（均P＜0.05），其中B组蛋白水平最低（均P＜0.01），A组与C组相比，同一时间点表达量相近，差异无统计学意义。与E组相比，D组表达量明显增高（均P＜0.05）。
结论：
1.RSV感染后Muc5ac蛋白表达增加，表明RSV感染可引起气道黏液高分泌；同时Notch1、Jagged1、IL-33表达增加，表明Notch1信号通路通过介导IL-33的释放参与RSV感染后气道黏液高分泌过程。
2.H33L42H3下调Notch1、Jagged1、IL-33的表达，通过抑制Notch1信号传导通路介导的IL-33的释放，同时，DAPT干预后可抑制RSV感染后Notch1信号通路的激活，与H33L42H3具有相同效应，进一步证实H33L42H3可通过抑制Notch1信号传导通路介导的IL-33的释放，参与调控RSV感染气道黏液高分泌过程。