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有机磷杀虫剂——敌百虫是水产养殖过程中大量应用的水体消毒剂和鱼体杀虫剂,但是敌百虫在杀灭寄生虫的同时也会对非标靶生物如鱼类产生毒副作用,危害鱼体健康。基于上述问题,本研究以异育银鲫为模式动物,探讨了敌百虫对异育银鲫抗氧化应激系统的影响及抗坏血酸对肝脏的保护作用。试验分别研究了敌百虫对异育银鲫仔鱼(1.0±0.3g)和幼鱼(43.3±3.9g)96h的LC50和安全浓度及对鱼体的抗乙酰胆碱酯酶作用；敌百虫胁迫对异育银鲫的氧化应激,肝脏细胞凋亡及肝脏脂肪代谢的作用；并结合体外试验,应用体外培养的原代肝脏细胞进一步研究了敌百虫诱导肝脏细胞凋亡的途径；探讨了抗坏血酸对敌百虫胁迫下异育银鲫的保护作用。1敌百虫对异育银鲫急性中毒试验及其抗AChE活性的作用本研究探讨了敌百虫对异育银鲫仔鱼和幼鱼的96h半致死浓度(LC50)及敌百虫对鱼体血浆中乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的变化。试验采用静水法生物测试,根据试验期间死亡鱼数及死亡时间,用Bliss-Finney去计算了96h的LC50。并测定了当敌百虫浓度为1和45mg·L-1时,幼鱼在3、5、8、10、24、48、72、96h血浆AchE的活性。结果表明,敌百虫对异育银鲫仔鱼96h的LC50为47.82mg·L-1,安全浓度为4.78mg·L-1；对异育银鲫幼鱼96h的LC50分别为39.06mg·L-1,安全浓度为3.91mg·L-1。与对照组相比,当幼鱼在敌百虫浓度为1和45mg·L-1时,血浆AChE的活性显著降低,并随着时间的延长其活性不可恢复。2敌百虫对异育银鲫肝脏抗氧化应激系统和细胞凋亡的影响试验采用静水式补水换药法,将异育银鲫分别在浓度为0、0.5、1、2和4mg·L-1的敌百虫水体中连续饲养30d后,取血清和肝脏组织进行抗氧化应激系统相关指标以及肝脏细胞凋亡的测定,探讨了敌百虫对异育银鲫抗氧化应激系统和肝脏细胞凋亡的影响。结果表明：与对照组相比,在敌百虫胁迫下,肝脏中总一氧化氮合成酶(T-NOS)和黄嘌呤氧化酶(XOD)活性显著升高；肝脏脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量除在4mgg·L-1处理组显著性增加(p<0.05)。血浆超氧化物歧化酶(SOD)活性在0.5和1mg·L-1组增加,在2和4mg·L-1组降低；过氧化氢酶(CAT)活性在1mg·L-1组增高,其余各处理组其活性降低；血浆维生素E(VE)含量增加。对肝脏TUNEL细胞凋亡原位检测表明,在处理组1、2和4mg·L-1中鱼体肝细胞凋亡数量呈增加趋势。试验各组的细胞凋亡率分别为0.24%,0.66%,3.72%,11.51%and28.33%。结果表明敌百虫对鱼体可以产生长期慢性的毒性,促使机体发生氧化应激,过量的自由基破坏抗氧化应激系统,引发生物膜脂质过氧化反应产生脂质过氧化物,造成细胞损伤,引起细胞凋亡。3敌百虫诱导异育银鲫体外原代肝脏细胞凋亡的研究试验将体外培养的异育银鲫原代肝脏细胞暴露在含敌百虫浓度为0,0.01,0.1和1.0mg·L-1的培养液24h后,分别测定细胞活性、细胞氧化应激和细胞凋亡率并通过透射电镜观察肝脏细胞的细胞器结构。结果表明,随着敌百虫浓度的增加,细胞内活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量显著升高；细胞活性随敌百虫浓度的增加而降低,细胞凋亡率升高；线粒体中细胞色素C (cyt C)含量降低,胞质中cyt C水平增高；细胞凋亡蛋白酶半胱天冬酶-3(caspase-3)的活性升高。通过AO/EB荧光染色显示肝脏细胞核DNA断裂,出现凋亡小体；透射电镜观察结果表明细胞器结构出现损伤,线粒体空泡化,并且在细胞中脂肪大量堆积。敌百虫可以引起肝脏细胞脂质过氧化反应,过量的自由基可以对细胞器结构和功能造成损伤使线粒体内的cyt C大量释放进入细胞质中,激活了胞质中半胱天冬酶系的级联活化,最终由caspase-3启动凋亡。4敌百虫对异育银鲫肝脏组织脂肪代谢的影响本试验采用静水式补水换药法,将异育银鲫分别在浓度为0、0.5、1、2和4mg·L-1的敌百虫水体中连续饲养30d后,取血清和肝脏组织测定脂肪代谢系统相关指标,探讨了敌百虫对鱼体肝脏组织脂肪代谢的影响。结果表明,敌百虫诱发血浆中胰岛素(Insulin)的含量上升、肝脏中环一磷酸腺苷(cAMP)水平降低、激素敏感脂肪酶(HSL)活性下降、肝脏中甘油三酯(TG)含量增高、载脂蛋白B (apo B)和极低密度脂蛋白(VLDL)含量降低。综上所述,敌百虫阻止肝脏中脂肪分解和转运。5抗坏血酸对异育银鲫保护作用的研究本试验分两个部分：试验一,用含不同浓度的抗坏血酸(50、100、200、400和800μM)的培养液培养异育银鲫原代肝脏细胞,测定细胞活性、细胞内抗坏血酸含量和乳酸脱氢酶(LDH)活性；再将经抗坏血酸培养后的细胞用0.01mg·L-1浓度的敌百虫胁迫24h,测定细胞内总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性、丁酰胆碱酯酶(B-CHE)活性和细胞色素P450(cyt P450)的含量。结果表明,当体外添加的抗坏血酸的含量为50-200μM剂量时,肝脏细胞增殖能力增强,细胞抗应激能力提高。试验二,给鱼口服剂量为4.5和9mg·kg BW-1的抗坏血酸及联合剂量为1.5/4.5mg·kg BW-1的生育酚和抗坏血酸后,测定血浆中一氧化氮(NO)、免疫球蛋白M(IgM)和溶菌酶的含量。结果表明,给鱼口服灌注剂量为9mg·kg BW-1的抗坏血酸可以提高鱼血浆中的NO、IgM和溶菌酶的含量,提高鱼体的免疫能力。综上所述,有机磷杀虫剂——敌百虫可引起非标靶生物异育银鲫神经中毒,鱼体活力下降。在敌百虫长时间胁迫下,鱼体产生过量的自由基,发生氧化应激；过量的自由基导致脂质过氧化反应生成氧化脂质,并在肝脏中堆积；此外脂质过氧化反应损伤线粒体膜结构,使线粒体膜的通透性发生改变,线粒体内的凋亡因子cyt C外泄到胞质中激活胞质中caspase-3的活性最终启动细胞凋亡。敌百虫胁迫下,肝脏中apo B数量减少降低了肝脏中VLDL的组装水平,使由肝脏细胞合成的脂肪转运受阻,引起细胞中脂肪堆积。敌百虫可诱发血浆中胰岛素含量升高,导致肝脏中cAMP含量减少,降低了HSL磷酸化水平致使酶活性下降,脂肪分解作用减弱。抗坏血酸可以提高肝脏细胞的活力,增强肝脏细胞的抗氧化应激能力,提高鱼体的免疫力。