目的:肝癌是全球第二大常见的癌症,肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）占原发性肝癌的70%～90%是最主要的病理亚型。目前,肝癌的临床治疗手段主要有手术切除、化疗、放疗、经导管肝动脉化疗栓塞（transarterial chemoembolization,TACE）法、局部射频热消融（radiofrequency ablation,RFA）法、肝脏移植等治疗方法。肝癌手术仍然是根除肝癌的首选方法,而且肿瘤越小,五年生存率越高。然而当患者出现明显的肝癌症状就诊时,病情往往已比较严重,多数处于中晚期。肝癌晚期的患者由于不具备良好的肝储备功能,对介入化疗等治疗方法耐受力不足,常常使肝癌患者预后差,存活时间较短。因此,早期预后不良肝细胞癌患者的鉴定和中晚期肝细胞癌患者安全有效的治疗手段是目前研究的两大关键问题。肝细胞癌的发生、发展、转移和复发与机体的免疫系统密切相关,肝脏组织中含有大量的淋巴细胞,其中NK细胞约占总肝淋巴细胞的30%,远远超出了NK细胞在外周血中的占比,提示NK细胞在肝细胞癌免疫治疗中可能发挥着重要的作用。NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力取决于细胞上抑制性受体和激活性受体的协同作用,当激活性受体与配体结合产生的信号更强时就能够激活NK细胞发挥抗肿瘤作用。NKG2D受体是NK细胞的主要激活性受体,几乎在所有的NK细胞上都有表达,无需致敏可直接通过与相应配体的结合发挥作用。MICA和MICB是最早发现的NKG2D配体,表达于大多数上皮性肿瘤细胞表面,可与NKG2D结合激活免疫反应,募集NK细胞对表达MICA/B的细胞进行有效的免疫杀伤。然而,MICA/B会随着肿瘤细胞的增殖而脱落,逃避免疫细胞的杀伤。因此,上调肿瘤细胞表面MICA/B分子的表达,能够有效增强肿瘤细胞对NK细胞杀伤活性的敏感性,从而逆转肿瘤免疫逃逸反应。为此,通过鉴别MICA/B在不同组织中的调控机制不同,来探索肝细胞癌中MICA/B分子的调控机制的重要性。人前梯度蛋白2（anterior gradient protein 2,AGR2）在乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌和前列腺癌等肿瘤组织中差异高表达,可作为癌症治疗的靶点。已有研究报道,通过计算机程序基于AGR2蛋白序列筛选出能够与HLA-A*0201结合的AGR2表位肽,可以被树突状细胞（dendritic cell,DC）递呈给T细胞,成功诱导HLA-A*0201限制的AGR2特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）,显著增强了T细胞的免疫活性,发挥靶向抗肿瘤免疫效应。前期研究中我们发现,AGR2表位肽孵育DC细胞后,DC细胞上的NK细胞激活性配体MICA/B表达量显著升高,提示我们AGR2表位肽可能调控MICA/B的表达。T细胞表位肽的研究目前仅局限于诱导肿瘤靶向CTL,在影响NK细胞抗肿瘤免疫效应中尚未见报道。本研究内容是分析AGR2表位肽如何增强NK细胞对肝癌细胞的杀伤作用;研究AGR2表位肽通过上调肝癌细胞上MICA/B分子的表达,增强肝癌细胞对NK细胞杀伤活性的敏感性;探索AGR2表位肽调节肝癌细胞MICA/B分子表达的分子机制;验证AGR2表位肽在体条件状态下能否影响肝癌移植瘤内MICA/B分子的表达,进而增强NK细胞对肝细胞癌的治疗效果。通过以上研究,拟为肝细胞癌临床NK细胞免疫治疗提供理论基础。研究方法:1.NK细胞获取纯化:收集健康志愿者的新鲜外周血,通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离单个核细胞（peripheral blood monocyte cells,PBMCs）,免疫磁珠法分选纯化CD3-CD56+的NK细胞。2.NK细胞功能检测:AGR2表位肽处理NK细胞后,采用ELISA检测IFN-γ、颗粒酶B和穿孔素的产生量;采用流式细胞术检测NK细胞表面NKG2D受体分子的表达;流式细胞术检测NK细胞脱颗粒功能指标CD107a的表达。乳酸脱氢酶释放实验检测NK细胞对肝细胞癌细胞的杀伤率。3.MICA/B含量检测:AGR2表位肽孵育肝细胞癌Bel-7402和Huh-7细胞24 h后,采用qRT-PCR检测MICA和MICB分子的基因表达;采用流式细胞术检测MICA/B抗原在细胞表面的表达;采用Western Blot检测MICA/B分子在细胞膜蛋白中的蛋白表达。脱落的可溶性MICA/B分子,采用ELISA检测AGR2表位肽处理肝癌细胞后培养基中MICA和MICB分子的含量。4.染色质免疫共沉淀:CHOP抗体结合在MICA/B启动子区域的AP-1转录激活因子,Western Blot检测免疫共沉淀的AP-1蛋白含量,转录因子CHOP和AP-1复合体调控MICA/B分子的转录,PCR检测MICA和MICB启动子区域基因含量。5.动物实验:采用4周雌性NOD/SCID免疫缺陷鼠构建人源肝癌细胞系Bel-7402移植瘤模型,瘤内注射AGR2表位肽联合NK细胞尾静脉注射治疗,检测移植瘤体积及移植瘤重量的变化趋势。6.数据分析:采用SPSS 16.0统计分析软件。组间比较采用独立样本T检验分析,数据以平均值±标准差的形式表示。结果:1.AGR2表位肽增强了NK细胞对肝细胞癌的杀伤效果。LDH乳酸脱氢酶实验结果显示,NK细胞对AGR2表位肽处理的肝细胞癌Bel-7402和Huh-7细胞的杀伤率在效靶比为2:1时分别由25.36%±2.41%提升到45.29%±1.82%,由24.31%±0.49%提升到38.87%±1.06%;在效靶比为4:1时分别由41.67%±5.50%提升到65.31%±1.60%,由45.79%±1.11%提升到62.20%±1.59%,均显著提高。NKG2D抗体封闭NK细胞NKG2D受体,AGR2表位肽不能有效增强NK细胞对肝癌细胞的杀伤能力。2.AGR2表位肽上调肝癌细胞MICA/B分子的表达。qRT-PCR检测AGR2表位肽处理肝癌细胞,Bel-7402细胞MICA和MICB mRNA的表达量提高了2.45±0.34倍和1.99±0.44倍;Huh-7细胞MICA和MICB mRNA的表达量分别提高了2.06±0.53倍和1.74±0.46倍;Western Blot检测Bel-7402和Huh-7细胞膜蛋白中MICA/B蛋白含量分别增加2.52±0.33倍和1.51±0.26倍;流式细胞术检测AGR2表位肽处理肝细胞癌Bel-7402和Huh-7细胞表面MICA/B平均荧光强度分别由370.06±51.01增加到488.47±24.54,由270.54±75.39增加到335.94±88.02,差异均具有统计学意义。3.AGR2表位肽通过激活P38 MAPK信号通路,上调转录因子CHOP蛋白表达,通过与转录激活因子AP-1结合成CHOP/AP-1复合体,调控肝细胞癌中MICA/B的转录,上调MICA/B的表达水平。qRT-PCR检测发现P38特异性抑制剂SB203580显著削弱AGR2表位肽上调肝癌细胞MICA/B的能力,流式细胞术检测发现SB203580抑制AGR2表位肽上调肝癌细胞表面MICA/B抗原蛋白的作用。我们采用Western Blot检测了AGR2表位肽处理肝癌细胞后P38蛋白表达无变化的同时P38磷酸化蛋白表达量显著增多,CHOP蛋白表达量也显著提高。采用ChIP免疫共沉淀检测发现AGR2表位肽处理的肝癌细胞CHOP抗体沉降的AP-1蛋白含量增加,PCR琼脂糖电泳检测发现MICA和MICB启动子区域DNA含量增加。4.NOD/SCID鼠模型验证AGR2表位肽在体能够有效增强NK细胞抑制移植瘤的生长,且效果能够被P38 MAPK抑制剂SB203580显著减弱。移植瘤内注射AGR2表位肽治疗后,qRT-PCR检测移植瘤内MICA和MICB mRNA的表达量显著升高、Western Blot检测移植瘤MICA/B蛋白含量明显升高、流式细胞术检测移植瘤MICA/B抗原表达显著增加。结论:1.AGR2表位肽能够上调肝细胞癌Bel-7402和Huh-7细胞中MICA/B的表达,增强肝癌细胞对NK细胞杀伤活性的敏感性。2.AGR2表位肽通过激活P38 MAPK信号通路,上调转录因子CHOP蛋白表达,与结合在MICA/B启动子区域的转录激活因子AP-1结合成CHOP/AP-1复合体,调控肝细胞癌中MICA/B的转录,进而上调MICA/B的表达水平。3.AGR2表位肽显著增加肝细胞癌移植瘤内MICA/B基因和蛋白的表达水平,其联合使用可以提高NK细胞对移植瘤生长的抑制作用,且SB203580可以抑制AGR2表位肽的效应,在体证明P38 MAPK是调节AGR2表位肽上调肝细胞癌MICA/B表达的主要信号通路。