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基因突变一直是研究基因功能的最有效方法。随着现代基因组测序技术的迅速发展，大量的基因或其调控因子功能需要鉴定。因此建立精确、高效的基因组定点突变技术，运用反向遗传学方法研究基因（或 DNA）的功能是当前功能基因组学研究的热点之一。人工介导的锌指核酸酶技术（ZFN）、类转录激活因子样效应物核酸酶技术（TALEN）和RNA介导的规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)系统都可以精确地在基因组的特定位点上产生DNA双链切口，进而经细胞内源性修复机制（同源重组修复或非同源末端连接）的修复而实现基因插入、缺失和碱基替换等突变。与传统的基因组编辑技术相比，基因编辑新技术不仅保留了可定点修饰的特点，还可应用到更多的物种上，大大提高了基因定点突变效率，其载体的构建时间缩短，成本降低，为实现基因组定点突变提供广阔的平台。然而，最近的研究发现，CRISPR系统脱靶率非常高。 本研究利用DNA洗牌技术一次性克隆多个基因，并实现一次性定点突变二个氨基酸位点。利用DNA洗牌技术构建了表达载体，首次在植物中利用引导 RNA偶联核酸内切酶(guided RNA and tethered endonuclease，GRATEN)用于基因组编辑，研究GRATEN系统介导的基因组编辑技术在植物基因组中定点突变的可能性。在烟草叶片中瞬时表达，并进行了致突变的初步研究。 GRATEN系统包含蛋白质和RNA二部分，将二组分克隆到同一植物表达载体。蛋白质组分包含来自于噬菌体MS2外壳蛋白（MS2 coat protein，MCP）和核酸内切酶FokI的切割结构域，MCP的N和C端分别融合FokI，表达后形成FokI:MCP:FokI融合蛋白。RNA组分包含串联的指导RNA（guided RNA，gRNA）和MCP结合RNA。gRNA与目标DNA通过碱基配对而识别并结合到靶DNA，MCP以二聚体的形式与形成特定二级结构的RNA结合，由此在靶DNA特定位点形成FokI二聚体，切割DNA，产生双链断裂，经细胞内修复机制（主要为非末端连接，Non-Homologous End Joining，NHEJ）产生碱基替换、缺失和插入等突变。 利用GRATEN系统，我们选择本氏烟草（Nicotiana benthamiana）八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase，PDS）基因作为打靶基因。结果显示可产生较高（约35.7％）基因突变率。我们的研究结果初步说明GRATEN系统可用于植物（有可能在其他生物）基因组定点突变，为功能基因组研究、基因治疗等提供了一种新的设计思路和技术。