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核酸酶P(RNaseP)是一种核蛋白复合物，它主要识别和切割前体tRNA的前导序列以产生成熟形式的tRNA。RNaseP具有两个独特的特性：它是所有生物体内含量最多、最稳定、最有效的核酸酶：它的诱导反应机制取决于对靶标RNA高级结构的识别，而不是依赖于对靶标RNA一级结构的识别。由两个核酸分子组成并具有类tRNA结构的复合物可被RNaseP特异地识别和切割，该复合物中的其中一个小分子RNA被称为EGS(ExternalGuideSequence，外指引序列)。EGS诱导RNaseP对其靶标RNA进行识别和切割，但不会导致非靶标RNA被降解。EGS的靶标特异性由以下两种分子间相互作用所决定：EGS的靶标配对区域与靶标RNA中的靶标区域的碱基互补作用；靶标RNA与EGS的类tRNA结构(相当于tRNA中的“T-stem”、“T-loop”和“VailiableRegions”结构)的相互作用。“3/4EGS”衍生于大肠杆菌的酪氨酸转运RNA(tRNATyr)，其效能已被大量的实验结果所验证。“3/4EGS”由靶标配对序列(与靶标RNA的靶标序列互补配对)和RNaseP识别序列(部分天然tRNA序列)所组成。
基于RNA文库的反向遗传筛选、突变筛选以及基因敲除等研究使1500多个秀丽隐杆线虫基因与表型建立联系。但秀丽隐杆线虫基因组中20000多个预测基因中大部分基因的功能有待研究。不同研究者利用RNAi文库对秀丽隐杆线虫进行反向遗传筛选所获取的结果存在较大差异。即使同一研究者采用同样的实验步骤，各次实验间的RNAi筛选结果仍有10％～30％的变异性。这要求建立新的反向遗传筛选工具以推动秀丽隐杆线虫的反向遗传筛选。
本文在验证EGS技术可用于干扰秀丽隐杆线虫的基因表达的基础上，设计和构建了EGS文库，并验证其对秀丽隐杆线虫进行了反向遗传筛选的有效性。
秀丽隐杆线虫的绿色荧光蛋白(gfp)转基因株(PD4251)中具有两种绿色荧光蛋白，一种是具有核定位信号的绿色荧光蛋白(Ngfp)--由Ngfp-lacZmRNA编码，另外一种是具有线粒体定位信号的绿色荧光蛋白(Mtgfp)--由MtgfpmRNA编码。
本文选择Ngfp-lacZmRNA和MtgfpmRNA作为EGS的靶标mRNA，以验证EGS技术用于干扰秀丽隐杆线虫基因表达的可行性。在RNA二级结构预测软件的辅助下，以“3/4EGS”为设计框架设计了靶向Ngfp-lacZmRNA的EGS-Ngfp-lacZ和靶向MtgfpmRNA的EGS-Mtgfp。EGS-Ngfp-lacZ和EGS-Mtgfp的表达框被分别克隆至pET28a表达载体以构建pET28a-EGS-Ngfp-lacZ和pET28a-EGS-Mtgfp。pET28a-EGS-Ngfp-lacZ为含有EGS-Ngfp-lacZ表达框的重组载体，其EGS-Ngfp-lacZ表达框至于T7终止子和T7启动子的控制下；pET28a-EGS-Mtgfp为含有EGS-Mtgfp表达框的重组载体，其EGS-Mtgfp表达框至于T7终止子和T7启动子的控制下。分别以pET28a-EGS-Ngfp-lacZ和pET28a-EGS-Mtgfp为模板，PCR扩增EGS-Ngfp-lacZ-IVTT和EGS-Mtgfp-IVTT，以分别作为EGS-Ngfp-lacZ和EGS-Mtgfp的体外转录模板。利用体外转录技术，对EGS-Ngfp-lacZ和EGS-Mtgfp进行制备。EGS-Ngfp-lacZ和EGS-Mtgfp被单独或共同导入PD4251中。以“SoakingBuffer”处理的PD4251作为对照，EGS-Ngfp-lacZ或EGS-Mtgfp单独处理的PD4251的荧光强度有所下降，但EGS-Ngfp-lacZ和EGS-Mtgfp共同处理的PD4251的荧光强度明显下降。为了验证荧光强度的下降是由上述EGS诱导RNaseP对其相应靶标RNA进行识别和切割所导致的，利用荧光实时定量PCR技术(QPCR)对GFPmRNA的表达水平进行分析；GFPmRNA的表达水平是Ngfp-lacZmRNA和MtgfpmRNA的表达水平的代表。与“SoakingBuffer”处理的PD4251的GFPmRNA的表达水平相比，EOS-Ngfp-lacZ或EGS-Mtgfp处理的PD4251的GFPmRNA表达水平分别下降了32±4.3％和37±5.2％。EGS-Ngfp-lacZ和EGS±Mtgfp共同处理的PD4251的GFPmRNA表达水平下降了93±3.6％。为了进一步验证EGS-Ngfp-1acZ和EGS-Mtgfp对其靶标的干扰效力，利用蛋白质印迹技术(Westernblot)分析了Ngfp蛋白和Mtgfp蛋白的表达水平。与“SoakingBuffer”处理的PD4251的Ngfp蛋白和Mtgfp蛋白的表达水平相比，EGS-Ngfp-lacZ处理的PD4251的Ngfp蛋白的表达水平降低了54±5.1％，但Mtgfp蛋白的表达水平仅降低了4±6.3％。EGS-Mtgfp处理的PD4251的Mtgfp蛋白的表达水平降低了64±3.8％，但Ngfp蛋白的表达水平仅降低了6±3.3％。EGS-Ngfp-laeZ和EGS-Mtgfp共同处理的PD4251的Ngfp和Mtgfp蛋白的表达水平分别降低了67±5.6％，94±2.8％。
以“3/4EGS”为设计框架对EGS文库(LEGS)进行设计。EGS文库的设计如下：“3/4EGS”的靶标配对区域由随机碱基组成；在“CCA”序列的5’末端添加“UUU”序列以提供EGS的稳定性。EGS文库的表达框被克隆至pET28a表达载体以构建pET28a-LEGS。pET28a-LEGS为含有EGS文库表达框的重组载体，其EGS文库表达框至于T7终止子和T7启动子的控制下。把pET28a-LEGS转化至DH5α感受态细胞中以筛选pET28a-EGS-clone。pET28a-EGS-clone为含有EGS文库中某一特定表达框的重组载体，这一表达框至于T7终止子和T7启动子的控制下。为了检验EGS文库的克隆效率及其EGS表达框的组成是否符合理论设计，随机挑取pET28a-EGS-clone进行限制性内切酶分析、测序分析及比对分析。
上述分析结果表明本文构建的EGS文库并不存在倾向性克隆，其EGS表达框的组成基本满足理论设计。
随机挑取EGS对秀丽隐杆线虫进行反向遗传筛选，以验证EGS文库对秀丽隐杆线虫进行反向遗传筛选的有效性。以pET28a-EGS-clone为模板，PCR扩增EGS的体外转录模板--EGS-clone-IVTT；以EGS-clone-IVTT为模板，通过体外转录对EGS进行制备；把EGS导入各龄期的秀丽隐杆线虫野生株N2中；记录P0代和F1代的异常表型--不育、子代不育、产卵少、幼虫生长缓慢、幼虫滞育、幼虫死亡、成虫死亡、形态异常、肥胖、细长、麻痹、运动不协调。其中约有6％EGS能够诱导秀丽隐杆线虫的表型发生异常变化，如：幼虫生长缓慢，幼虫滞育，成虫死亡，和不育。对能够诱导秀丽隐杆线虫产生异常表型的EGS的靶标mRNA进行鉴定。通过BLAST分析以及RNAi表型与EGS诱导产生的异常表型的比较分析，EGS-35，EGS-83的靶标mRNA被初步鉴定为ZK858.7mRNANM_060051.2)和Lin-13mRNA(NM_066277.3)。
上述研究表明本文所构建的EGS文库可用于对秀丽隐杆线虫进行反向遗传筛选。