基于核酸适配子技术检测环境中重金属离子的研究

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核酸作为遗传信息的载体,不仅在生物的生命活动中发挥着重要作用,在生物体外也有广泛地应用。核酸适配子(适配子/适体,aptamer),是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选分离得到的一条DNA或者RNA分子,它可以与其靶物质(氨基酸、蛋白质、金属离子、甚至整个细胞)进行高亲和力、专一性结合。因此,它在生化分析、环境监测、基础医学、新药的合成及筛选等方面展现出广阔的应用前景。本文将以核酸适配子技术为基础,通过将其与小分子探针自组装技术和核酸链取代扩增技术相结合组建生物传感器,成功的实现了对环境中铅离子和银离子的痕量检测,取得了良好的分析效果。本论文的研究内容与成果如下:第一部分内容选用了凝血酶适体(thrombin aptamer TBA)和一个带正电荷的芘探针,由于核酸的磷酸骨架带负电,它可以诱导带正电荷的芘探针的集聚,集聚形成的激基缔合物会发射出荧光。实验选用的凝血酶适体富含G(鸟嘌呤),并且在铅离子存在的情况下,能够与铅离子结合并形成稳定的G-四联体结构,形成的G-四联体结构能够抵抗单链特异性核酸酶S1的降解。继而添加芘探针时,未被降解的G-四联体可以诱导芘探针的集聚,从而发出荧光,荧光强度与添加的铅离子浓度呈正比。因此,建立了一种简单、灵敏的铅离子检测方法。第二部分内容选用了一条富含胞嘧啶的单链核苷酸oligo-C和带两个正电荷的二萘嵌苯探针。在银离子存在的情况下,经过退火,银离子可以与胞嘧啶共价结合,形成C-Ag+-C错配结构,从而使单链核苷酸oligo-C回折形成发夹结构。随后添加二萘嵌苯探针,由于oligo-C回折形成了发夹结构,于是就减弱了oligo-C与二萘嵌苯探针之间的静电吸引作用,使二萘嵌苯探针单体被释放到溶液中,从而发出二萘嵌苯单体荧光,使溶液的荧光增强。以此原理检测溶液中的Ag+,并获得了5nM检测限。第三部分内容选用了一种铅离子依赖的核酸酶GR-5,在铅离子存在的情况下,其底物链会在核糖核苷酸处断裂,产生两条短的核酸链。其中5′端产物的3′末端为2′-3′环磷酸,在正常情况下,它不能作为引物进行核酸链的延伸。但是试验中发现核酸外切酶III可以切除5′端产物的3′末端的2′-3′环磷酸,使其5′端产物的3′末端暴露出-OH,进而它可以作为引物进行核酸链取代扩增反应。在信号扩增方式上选用恒温指数扩增,其特点为扩增效率高,反应条件要求简单等。最后使用分子信标通过碱基互补配对与扩增产物结合,从而实现了荧光信号的检出。这种方法具有选择性好,灵敏度高,背景低的特点,为生物传感器的构建提供了一种新的思路。
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