研究背景：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种以进行性记忆和认知功能损害为主要特征性表现的神经退行性疾病,是老年期痴呆最常见的类型,该病为慢性进行性病程,其致残率及致死率很高,其发病机制却不很清楚,目前主要有β淀粉样蛋白、乙酰胆碱神经元、基因、一氧化氮、微观相关蛋白tau、细胞因子、炎症等多种因素可能与AD的发病有关。许多研究表明,突触丢失、神经元脱失是AD患者重要的组织形态学改变之一,其程度与痴呆严重程度密切相关。AD目前尚无比较有效的治疗方法。传统的药物治疗主要有：改善脑循环药物、促进脑代谢剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、M1胆碱受体激动剂、促进乙酰胆碱释放剂、神经生长因子、抗氧化药物等,这些治疗手段能够减轻AD的症状,但无法恢复大量丢失的神经细胞,对于中晚期的AD患者治疗效果很有限。近来研究表明在合适的环境中干细胞能转变为神经细胞,起到修复受损神经组织的作用。神经干细胞(neural stem cell, NSC)在胚胎和成年个体神经系统中的发现和体外培养的成功为AD的治疗提供了一个新的途径和方向。利用自体干细胞修复受损神经组织的方法具有简便、很少引起免疫排斥反应,而且没有伦理学问题的困扰,因而具有长远而广泛的应用前景。粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)作为调节骨髓粒系造血的主要细胞因子之一,有动员骨髓干细胞增殖的作用,并使动员到外周的骨髓干细胞向脑损伤区迁移,修复受损的神经组织,从而改善AD小鼠模型认知功能。体外人神经干细胞培养和体内成年鼠脑的研究结果表明,G-CSF可诱导神经前体细胞的增殖和分化。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是强力的促血管生成因子,与VEGF受体结合后可诱导内皮细胞的增殖、迁移及生长,并形成血管网,血供的改善能够为神经的再生创造良好的环境,有利于神经干细胞的增殖和分化。近年来研究发现,VEGF还直接作用于神经元,促进神经突触的生长和延伸,有较强的神经保护和促进神经再生作用。由此我们设想将VEGF与G-CSF两者联合应用可能起到相互协同作用,更好得促进骨髓干细胞的增殖、迁移、分化,可能有利于神经组织的再生,改善突触可塑性。研究目的：第一部分：应用水迷宫检测APP转基因小鼠逃避潜伏期、空间探索策略及传越原平台所在象限次数及游泳时间百分比,探讨G-CSF联合VEGF对APP转基因小鼠认知功能的影响。第二部分：应用免疫组织化学方法检测APP转基因小鼠CD133,通过免疫荧光染色方法,检测BrdU+GAP-43,以期探讨G-CSF/VEGF联合干预对干细胞增殖和神经再生的影响。第三部分：应用免疫荧光双标记方法,检测BrdU+SYN,应用免疫组织化学方法,检测NCAM,探讨G-CSF/VEGF联合干预对突触可塑性的影响材料与方法：第一部分1.实验动物及给药：APPV7171转基因小鼠54只,随机分为G-CSF及VEGF联合组(简称联合组)、G-CSF组合对照组,每组18只小鼠,首先连续3天给予腹腔注射VEGF (8μg/kg·d),之后再连续7天给予皮下注射G-CSF(50μg/kg·d)。G-CSF组：共18只,首先连续3天给予腹腔注射与VEGF同体积的PBS,之后连续7天皮下注射G-CSF (50μg/kg·d).对照组：共18只,首先连续3天给予腹腔注射与VEGF同体积的PBS,再连续7天给予皮下注射与G-CSF同体积的生理盐水。各组小鼠再分为7天,14天机28天3个亚组,每个时间点6只小鼠。2.行为学检测：各组小鼠分别在给药前及给药后第7天、14天及28天进行Morris水迷宫测试,观察小鼠寻找并爬上平台的路线,记录小鼠活动路线图及爬上平台所需时间(逃避潜伏期)；之后将平台撤除进行小鼠的空间探索测试,记录60秒内小鼠再水池中的游动路线,计算出在60秒中小鼠在原平台所在的象限中游泳时间百分比,同时计算出小鼠穿越原平台所在位置的次数。3.统计学分析：实验结果均以x±s表示,统计学分析采用应用SPSS10.0统计软件进行,各组间差异采用方差分析,60秒中小鼠在原平台象限的游泳时间百分比、小鼠穿越平台所在位置的次数采用卡方检验,以P<0.05表示有统计学意义。第二部分1.实验动物分组及给药本实验共选用APP转基因小鼠54只,经过初筛之后,按照随机分配的原则将所有小鼠随机分为3组：G-CSF联合VEGF组(简称联合组)、G-CSF组和对照组,并分别给与不同的药物处理。联合组：共18只,首先连续3天给予腹腔注射VEGF(8μg/kg·d),之后,再连续7天给予皮下注射G-CSF(50μg/kg·d)。 G-CSF组：共18只,首先连续3d给予腹腔注射PBS,之后连续7d给予皮下注射G-CSF (50μg/kg·d)。对照组：共18只,首先连续3d给予腹腔注射PBS,再连续7d给予皮下注射生理盐水。各组小鼠在给药的同时,均连续10d给予腹腔注射BrdU (50mg/kg·d)。各组动物再按照随机分配原则分为7、14、28d3个亚组,每个亚组均为6只小鼠,分别于给药结束后第7天、14天、28天将小鼠处死并进行取脑。2.脑标本采集各组小鼠在给药后7、14、28d腹腔注射10%水合氯醛(0.38g/kg)进行麻醉,成功后依次给予PBS和4%多聚甲醛进行灌注固定,直到四肢僵直为止,然后取出脑部。将脑组织投入4%多聚甲醛溶液进行后固定20小时,之后依次放入30%及20%蔗糖溶液中各24小时。最后将固定后的小鼠脑部放入冰冻切片机中,经海马部制作冠状切片,片厚15μm,用于免疫组织化学组化检测。3.CD133免疫组织化学检测根据CD133抗体说明书所示的操作方法,CD133免疫组织化学实验步骤如下：将冰冻切片在室温中放置30分钟之后,用PBS液清洗3次,每次5分钟。再放入3%过氧化氢溶液中进行孵育5-10分钟,以消除内源性过氧化物酶对免疫组织化学结果的影响。再次用PBS清洗3次,每次5分钟,室温中再放入3%过氧化氢液10-20分钟,之后使用PBS洗涤2次,每次3分钟。室温条件下放入正常血清中进行孵育20分钟后滴加CD133抗体,4℃过夜。采用PBS液清涤3次,每次3分钟。再滴加二抗,在室温条件下静置30分钟,以PBS液清洗3次,每次3分钟。在室温条件下上液中加入PAP复合物静置60分钟,以PBS液清洗3次,每次3分钟。最后使用0.04%DAB液加0.03%过氧化氢溶液显色约5-10分钟后充分水洗,采用苏木精进行复染,晾干后封片显微镜下观察。4. BrdU+GAP-43免疫荧光双标记检测取冰冻切片,室温复温后,0.3%TritonX-100,30min, PBS洗3×5min；采用2MHCl37℃下处理60分钟,PBS液清洗3次,每次5分钟。然后滴加5%BSA封闭液,在室温下静置20分钟。之后甩去上面的液体,不用清洗。再滴加1：100倍稀释的BrdU一抗,在4℃环境下过夜。PBS液洗涤3次,每次2分钟。滴加1：100倍稀释的SYN一抗,在4℃环境下经过一夜时间后,以PBS液清洗3次,每次2分钟。其上再滴加山羊抗小鼠TRITC偶联二抗与山羊抗兔FITC偶联二抗的混合液(先经1：100稀释后),在37℃环境下静置20分钟。PBS清洗3次,每次2分钟,最后进行封片,在荧光显微镜下进行观察。BrdU阳性细胞显示为红色荧光,GAP-43阳性细胞为绿色荧光,BrdU/GAP-43双阳性细胞为黄色荧光,分别对BrdU/GAP-43双阳性细胞、BrdU阳性细胞数进行计数,计算出BrdU/GAP-43双阳性细胞占BrdU阳性细胞的百分数。5.统计学处理CD133免疫组织化学检测：在400倍显微镜下对海马区5个不重叠的视野进行随机计数,应用Leica QWinV3图像分析系统,计算平均灰度值。GAP-43/BrdU免疫组织化学荧光双标记检测：首先对GAP-43/BrdU双标记阳性细胞及BrdU阳性细胞分别进行计数,对脑片海马区5个不重叠的视野进行随机计数,计算出GAP-43/BrdU双标记阳性细胞占BrdU阳性细胞的百分数。应用SPSS10.0统计软件进行统计学分析,结果均以x±s表示,组间差异比较采用双侧t检验,以P<0.05表示有统计学意义。第三部分：1.实验动物分组及给药本实验共选用APP转基因小鼠54只,经过初筛之后,按照随机分配的原则将所有小鼠随机分为3组：G-CSF联合VEGF组(简称联合组)、G-CSF组和对照组,并分别给与不同的药物处理。联合组：共18只,首先连续3天给予腹腔注射VEGF (8μg/kg·d),之后,再连续7天给予皮下注射G-CSF (50μg/kg·d)。G-CSF组：共18只,首先连续3d给予腹腔注射PBS,之后连续7d给予皮下注射G-CSF (50μg/kg·d)。对照组：共18只,首先连续3d给予腹腔注射PBS,再连续7d给予皮下注射生理盐水。各组小鼠在给药的同时,均连续10d给予腹腔注射BrdU (50mg/kg·d)。各组动物再按照随机分配原则分为7、14、28d3个亚组,每个亚组均为6只小鼠,分别于给药结束后第7天、14天、28天将小鼠处死并进行取脑。2.脑标本采集各组小鼠在给药后7、14、28d腹腔注射10%水合氯醛(0.38g/kg)进行麻醉,成功后依次给予PBS和4%多聚甲醛进行灌注固定,直到四肢僵直为止,然后取出脑部。将脑组织投入4%多聚甲醛溶液进行后固定20小时,之后依次放入30%及20%蔗糖溶液中各24小时。最后将固定后的小鼠脑部放入冰冻切片机中,经海马部制作冠状切片,片厚15μm,用于免疫组织化学组化检测。3. BrdU+SYN免疫荧光双标记检测将冰冻切片在室温进行复温之后,首先采用0.3%TritonX-100处理30分钟,之后再用PBS清洗3次,每次5分钟；采用2MHC1在37℃下处理60分钟,再用PBS清洗3次,每次5分钟。之后滴加5%BSA液进行封闭,室温持续20分钟。甩去切片上的多余液体,不用清洗。滴加1：100经过稀释的brdU一抗,在4℃条件下过夜,用PBS清洗3次,每次2分钟。在切片上滴加1：100稀释的SYN—抗,在4℃条件下过夜,PBS清洗3次,每次2分钟。最后滴加山羊抗小鼠TRITC偶联二抗,以及1：100稀释的山羊抗兔FITC偶联二抗的混合液,在37℃条件下持续20分钟。PBS清洗3次,每次2分钟。全部步骤完成再封片。在荧光显微镜下,观察BrdU阳性细胞、BrdU/SYN双阳性细胞情况,计数BrdU/SYN双阳性细胞、BrdU阳性细胞数,并计算每个切片BrdU双阳性细胞占BrdU阳性细胞的百分数。4. NCAM免疫组织化学检测根据NCAM免疫组织化学染色说明书要求,具体操作步骤简述如下：将冰冻切片在室温下放置30分钟,PBS液洗涤5分钟,共3次。再使用3%过氧化氢溶液进行孵育5-10分钟以消除内源性过氧化物酶活性。再进行PBS洗涤5分钟,共洗3次,再次使用3%过氧化氢室温下孵育10-20分钟,之后PBS洗涤3分钟,共2次。使用二抗的正常血清在室温下进行孵育20分钟,再滴加NCAM抗体溶液,在4℃环境下经过一夜后,用PBS液进行洗涤3分钟,共3次。之后滴加二抗,在室温下静置30分钟后PBS液洗涤3分钟,共3次。再加PAP复合物保持室温下反应60分钟,PBS液进行洗涤3分钟,共3次。最后采用0.04%DAB+0.03%H2O:显色5-10分钟,充分用水进行洗涤,干后使用苏木精进行复染,封片后在显微镜下进行观察。5.统计学处理SYN免疫组织化学荧光双标记检测：计数SYN/BrdU双阳性细胞占BrdU阳性细胞的百分数。对海马区5个不重叠的视野进行随机计数,根据计数结果计算平均数。NCAM免疫组织化学检测：在400倍显微镜下对海马区5个不重叠的视野进行随机计数,应用Leica QWinV3图像分析系统,计算平均灰度值。应用SPSS10.0统计软件进行统计学分析,结果均以x±s表示,组间差异比较采用双侧t检验,以P<0.05表示有统计学意义。结果第一部分：1.逃避潜伏期检测：给药之前3组小鼠逃避潜伏期相差不大。其中联合组61.74±11.51s,G-CSF组62.91±27.22s,对照组：60.98±17.11s,P>0.05。给予G-CSF及G-CSF、VDGF联合干预后,经方差分析发现,G-CSF组及联合组小鼠认知功能明显改善,逃避潜伏期缩短,3组间有明显差异。在给药7天后即出现,联合组23.73±12.50s,G-CSF组27.19±4.07s,对照组46.07±7.21s,P<0.05。14天时有显著差异,联合组20.22±9.28s,G-CSF组26.48±5.29s,对照组42.99±11.70s,P<0.01。到28天时效果仍很明显,联合组20.81±10.46s,G-CSF组24.97±3.61s,对照组45.54±9.55s,P<0.01。2.搜索平台策略：实验小鼠采用的搜索平台策略有3种：空间策略、系统搜索策略和重复环绕策略。对照组小鼠多采用的是重复环绕策略,7天时为23%,14天39%,28天25%；各时间点小鼠采用空间搜索策略的比例大致相仿,占29%-33%。系统搜索策略分别为7天时45%,14天时39%,28天时52%。给予G-CSF后与对照组相比,搜索策略略有差别,G-CSF组小鼠以空间策略为主,各时间点比例较高：7天45%,14天55%,28天63%；系统搜索策略所占比例：7天38%,14天30%,28天20%；重复环绕策略较少采用：7天17%,14天15%,28天17%。给予G-CSF联合VEGF后小鼠搜索策略以空间策略比例显著增加,各时间点比例为：7天68%,14天76%,28天80%；系统搜索策略所占比例：7天23%,14天13%,28天10%；重复环绕策略：7天9%,14天11%,28天10%。经卡方分析各时间点三组间均有明显差别,P<0.05。3.小鼠穿越原平台所在位置的次数及原平台象限游泳时间百分比：将平台撤除后第7天时,联合组、G-CSF组及对照组穿过原平台所在位置的次数较对照组相比未发现明显增加：对照组2±2.58,G-CSF组2±2.53,联合组2±3.26,P>0.05。第14天G-CSF组和联合组小鼠穿越原平台所在位置的次数有明显增加：对照组2.67±2.16,G-CSF组4.5±1.64,联合组6.5±3.81,P<0.05。第28天对照组3.24±1.63,G-CSF组5.23±1.61,联合组6.23±1.89,P<0.05。联合组、G-CSF组和对照组间经卡方分析发现有显著差异,但28天时差别较14天时略有减少。原平台象限游泳时间百分比：7天时对照组35.38±5.33%,G-CSF组34.37±7.43%,联合组：37.24±5.71%,P>0.05,联合组、G-CSF组与对照组相比无统计学差别。14天时对照组35.12±14.13%,G-CSF组56.24±17.19%,联合组59.24±18.69,P<0.05。第28天时,对照组35.67±9.79,G-CSF组48.42±16.41,联合组54±14.37,P<0.05,联合组、G-CSF组和对照组间均有明显差异,但差别较14天时减小第二部分：1.CD133免疫组织化学染色在CD133免疫组织化学染色片中,CD133主要表达在神经细胞的胞质和胞膜表面,呈境界清晰的棕黄色,随着给药时间的延长,CD133阳性神经细胞数目逐渐增加,对照组在各个时间点CD133的表达均处于较低水平,给药后7、14、28d联合组较G-CSF组和对照组表达明显增高,P<0.05。2. BrdU/GAP-43免疫荧光双标记染色在海马区Brdu/GAP-43荧光染色片中,Brdu阳性细胞标记为红色,GAP-43阳性细胞标记为绿色。可见部分标记为黄色的Brdu/GAP-43双标记阳性细胞。联合组在给药后7d起即可见到较多的双标记阳性细胞,随给药时间的延长,双标记阳性细胞数明显增加,28d时双标记阳性细胞百分数达(17.26±3.29)%,在7d、14d、28d三个时间点联合组双标记阳性细胞百分数均较G-CSF干预组及对照组明显增加,P<0.05。第三部分：1. BrdU/SYN免疫荧光双标记染色应用免疫荧光双标染色,荧光显微镜下观察,在海马区BrdU/SYN荧光染色切片中,红色标记的是BrdU阳性神经细胞,为干细胞来源,绿色标记的是SYN阳性神经细胞,为新生突触,可见部分TRITC标记的红色BrdU阳性细胞同时表达FITC标记SYN(绿色),为干细胞分化为神经细胞中新生突触蛋白。联合组在给药后第7天即可见BrdU/SYN双标记阳性细胞,并随时间的延长,双标记阳性细胞数目逐渐增多,28d时BrdU/SYN双标记阳性细胞百分数达(14.47±1.38)%,14、28d时联合组较G-CSF组及对照组SYN阳性细胞百分数明显增加,P<0.05。2. NCAM免疫组织化学染色在NCAM免疫组织化学片中,NCAM呈棕褐色,主要表达在神经细胞的胞质和胞膜表面,从用药后第7天起联合组NCAM阳性神经细胞缓慢增加,在给药后14d、28d联合组NCAM较G-CSF干预组及对照组表达明显增高,P<0.05结论：第一部分：给予APPV7171转基因小鼠G-CSF能显著减轻小鼠认知功能损害,其作用自用药后7天出现,可持续到28天,给予G-CSF/VEGF联合用药,可显著促进小鼠的认知功能,其作用较G-CSF组更加明显。第二部分：G-CSF联合VEGF能提高APP转基因小鼠海马区干细胞标记物CD133的表达水平,增强干细胞在脑损伤区的增殖。G-CSF联合VEGF能增加APP转基因小鼠模型神经再生标志物GAP-43的表达水平,双标记显示干细胞标记物BrdU表达也增加,表明G-CSF联合VEGF能促进海马区神经再生,可能与干细胞在海马区的增殖有关。3. G-CSF联合VEGF能提高APP转基因小鼠突触可塑性标志物NCAM及SYN在海马区的表达水平,说明两种药物联合应用能够促进突触再生,改善突触可塑性。