L-脯氨酸是参与蛋白质组成的20种常见氨基酸中唯一的一种亚氨基酸，在医药领域中是复方类输液的重要氨基酸之一；在化学合成中作为小分子催化剂具有良好的手性催化效果；在抵抗极端环境下L-脯氨酸在生物体内发挥着特殊的生物学功能，对维持机体正常的生命活动起着重要的作用。因此，随着L-脯氨酸在医药、食品、化工及农业上的应用日益广泛，L-脯氨酸的需求不断增加。本论文以实验室保藏的一株L-脯氨酸生产菌株作为出发菌株，通过对其进行分子生物学鉴定及生理生化鉴定，确定其为一株缺陷短波单胞菌Brevundimonas diminutaJNPP^-1，随后对其进行紫外线、亚硝基胍复合诱变及筛选，并通过进一步的单因素及正交试验设计对其摇瓶发酵条件进行优化，最后在5L发酵罐上对L-脯氨酸分批补料发酵工艺进行了初步的研究。主要结论如下：1.分别采用生理生化试验及16S rDNA基因序列比对，对出发菌株JNPP^-1进行鉴定，确定JNPP^-1属于缺陷短波单胞菌属Brevundimonas diminuta。目前，在国内外利用缺陷短波单胞菌生产L-脯氨酸尚无文献报道。2.以B. diminuta JNPP^-1为出发菌株，根据微生物L-脯氨酸代谢途径分别建立了磺胺胍抗性筛选模型、琥珀酸钠生长优势筛选模型、高盐筛选模型三个高产菌株的筛选模型，采用紫外线及亚硝基胍复合诱变，筛选获得一株代谢稳定的高产菌株JNPP-NSS，发酵结束时，L-脯氨酸的累积浓度可达45.0g·L^-1，较出发菌株产酸提高42.0%。3.通过单因素实验及正交实验设计对B. diminuta JNPP-NSS的摇瓶发酵培养基进行条件优化，研究表明，葡萄糖及谷氨酸钠的添加浓度对发酵液中L-脯氨酸的积累影响显著，确定摇瓶发酵培养基的最佳组成为(g·L^-1)：葡萄糖100，硫酸铵55，酵母粉30，磷酸氢二钾2.5，七水硫酸镁0.3，硫酸锌0.01，硫酸锰0.01，谷氨酸钠50，碳酸钙4.5；生物素50μg，硫胺素50μg，装液量30mL/500mL，初始pH8.0。在此发酵条件下振荡培养62h后，L-脯氨酸积累量可达到49.2g·L^-1，比优化前提高了9.3%。4.针对摇瓶分批发酵过程中延滞期较长，L-脯氨酸的产率、生产强度均较低的现象，在5L发酵罐上分别针对B. diminuta JNPP-NSS的葡萄糖、谷氨酸钠分批补料的补加策略进行研究。实验结果表明当谷氨酸钠初始添加浓度为50g·L^-1，发酵33h时开始以0.9g·L^-1·h^-1进行谷氨酸钠流加，发酵61h后L-脯氨酸在发酵液中积累量可达57.6g·L^-1，比分批发酵提高18.2%，生产强度由摇瓶分批发酵的0.786提高到0.944g·L^-1·h^-1。