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目的和意义:类风湿关节炎(RA)是一种常见的、多发的周围关节的慢性炎症,严重危害人类的健康。RA具有临床异质性和遗传异质性的特点,加之环境因素的影响,制约了其分子机制的研究,因此关节炎动物模型的采用为发病机制的探讨提供了理想的平台。无论在RA患者还是实验性关节炎模型上,Toll样受体(TLRs)都受到了类风湿病学家的关注。本研究拟以pristane诱导的关节炎(PIA)为研究对象,首先获得模型大鼠脾脏等免疫器官和滑膜组织的TLRs表达谱,筛选出在PIA中发挥重要作用的关键TLRs,通过多种关节炎模型验证其作用并进一步研究其作用机制,为阐明RA的发病机制提供实验和理论基础,也为RA的治疗和新药研发提供新的靶点。方法与结果:1.以对关节炎敏感的近交系DA大鼠构建PIA模型,在D0、D6和D26取脾脏,通过real-time PCR检测TLR1-9和相关细胞因子的mRNA表达水平,结果显示TLR3 mRNA表达水平在D6和D26均显著上调,TLR1、TLR2、TLR4、TLR8表达只在D26显著上调;IFN-β表达与TLR3趋势一致,TNF-α和IL-6 mRNA表达水平仅在D6升高。2. (1)以DA大鼠构建PIA和CIA模型,在D0、D26和D70取脾脏,通过real-time PCR检测TLR1-9的mRNA表达水平,结果显示TLR3,6,9在急性期和慢性期均显著上调;(2)以phytol处理DA构建的PIA大鼠,发现phytol+pristane组临床计分显著低于pristane组;在D6和D26时取脾脏,通过real-time PCR检测TLR1-9和相关细胞因子的mRNA表达水平,在D26时phytol+pristane组脾脏中TLR1、TLR2和TLR3表达显著低于pristane组;(3)以MTX处理PIA模型,发现MTX干预组没有表现出明显的关节炎症状,在D20时该组的TLR3 mRNA表达相对于PIA组显著下调。3.构建PIA模型,在D6和D26时取脾脏细胞,通过FACS检测膜TLR3阳性表达的细胞比例和荧光强度,结果显示膜TLR3阳性表达的细胞比例在D6和D26时显著增加;通过FACS检测各型细胞数量时发现在PIA进程中T细胞数量呈下降趋势,而巨噬细胞在D2和D26的细胞数都增高;在D2和D26时巨噬细胞中膜TLR3阳性的细胞比例显著增加,D6时平均荧光强度显著增高。4.使用TLR2、3、4、9的配体PGN、polyI:C、LPS、CpG以及生理盐水(对照组)在踝关节腔局部刺激PIA大鼠,发现polyI:C组与生理盐水组相比疾病严重程度显著提高,PGN组次之;对踝关节切片进行HE染色和病理学评分,结果显示polyI:C组的滑膜炎、关节破坏、新骨与软骨形成的病理学计分及总计分与生理盐水组相比都有显著差异,PGN组仅在关节破坏的病理计分和总病理计分上与生理盐水组有显著差异;通过生物学方法检测血清中TNF-α浓度,结果显示与其它各组相比polyI:C组显著升高。5.对PIA大鼠腹腔注射干扰TLR3表达的shRNA质粒,发现与shRNA-NC组以及生理盐水处理组相比,shRNA-TLR3处理的PIA大鼠临床计分显著降低,发病时间也较其它两组都晚,关节炎临床最大分值显著降低。6.制备pristane乳剂,将浓度调整为0.1、1、10、100μM、1mM和10mM,刺激NR8383(巨噬细胞)48h后提取RNA,通过real-time PCR检测TLR3 mRNA水平,发现不同浓度pristane刺激后其表达水平均表现出显著上调,并呈现出剂量依赖性;以100μM pristane作用于NR8383,分别在刺激0h,12h,24h,48h和72h收集细胞,检测其TLR3 mRNA表达,发现在pristane刺激下其表达呈现时间依赖性;采用TLR3抗体阻断或者shRNA-TLR3干扰均可降低IFN-βmRNA的表达。7.构建PIA大鼠,在D0、D6、D12和D26时取踝关节滑膜组织检测TLR1-9及相关细胞因子mRNA表达,结果显示滑膜中的TLR3 mRNA表达升高早且持续;免疫组织化学检测显示TLR3主要表达在FLS上;对PIA大鼠踝关节局部注射polyI:C或者生理盐水,发现polyI:C可加重PIA病情;培养大鼠FLS,与PIA大鼠脾脏T细胞共孵育后通过real-time PCR检测其TLR3及相关炎症介质的mRNA表达,结果显示TLR3表达水平升高,FLS合成IFN-β、IL-6、MMP3和MMP13的能力增强;划痕实验显示FLS的迁移功能也增强。主要结论:1.脾脏中巨噬细胞可通过TLR3介导PIA的炎症反应过程,其高表达与PIA的发生和发展密切相关。2.活化的脾脏T细胞可刺激FLS高表达TLR3,进而促进其迁移和炎症介质分泌的能力,从而启动和介导关节局部炎症。