【摘 要】
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超声波作为一种预处理手段在促进蛋白酶解制备功能多肽中具有显著的效果,微型光纤式近红外光谱技术可以被成功应用于酶解过程关键信息的原位实时监测,近年来包括本课题组在内的国内外学者围绕上述两方面的内容开展了大量的研究工作,取得了卓有成效的进展,但是在关于超声波扫频工作模式的实现方式、基于近红外光谱原位实时监测的蛋白酶解过程智能化控制系统的构建等研究工作还不够深入,没有充分发挥物理手段对蛋白酶解过程的促进
【基金项目】
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国家自然基金(NO.32072353):超声胁迫下鲜切紫甘蓝体内酚类物质的多层积累及其生物学机制研究; 江苏省重点研发计划(NO.BE2018368):智能化绿色高效食品超声波生物制造装备开发;
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超声波作为一种预处理手段在促进蛋白酶解制备功能多肽中具有显著的效果,微型光纤式近红外光谱技术可以被成功应用于酶解过程关键信息的原位实时监测,近年来包括本课题组在内的国内外学者围绕上述两方面的内容开展了大量的研究工作,取得了卓有成效的进展,但是在关于超声波扫频工作模式的实现方式、基于近红外光谱原位实时监测的蛋白酶解过程智能化控制系统的构建等研究工作还不够深入,没有充分发挥物理手段对蛋白酶解过程的促进与提升作用。大米蛋白是一种资源充裕、营养丰富的植物蛋白,将其酶解制备生物活性肽具有重要商业价值。本课题以大米多肽的酶解法制备为研究对象,首先进行可以实现不同扫频工作模式超声波电源的设计及其在大米蛋白酶解前原料预处理中应用的试验研究,其次进行酶解产物ACE抑制活性的构效关系研究以及基于微型光纤近红外光谱技术的酶解过程产物ACE抑制活性的原位实时监测技术研究,最后进行酶解终点判别和双酶酶解柔性切换的智能化控制系统的构建。主要研究内容和结论如下:(1)研制出随机步长扫频(以下简称随机扫频)超声波电源。电源的整流电路采用双向可控硅调功,可实现多级功率调节;逆变电路采用单片机结合数字频率合成器,能够快速跟踪到超声换能器的谐振频率,并可调整到以28 kz为中心频率的定频、周期扫频或随机扫频频率激发模式。输出端采用串联电感进行调谐、高频变压器进行阻抗匹配,额定功率可达600 W。(2)研究了扫频超声预处理对大米蛋白酶解强化效果的影响。以水解度和酶解产物ACE抑制率为考核指标,采用上述研制的新型扫频超声设备对大米蛋白进行预处理,比较定频、周期扫频和随机扫频三种频率模式下的酶解效果。对比研究发现,三种模式均提高了水解度和酶解产物ACE抑制率,其中随机扫频超声模式和定频模式优于周期扫频,且随机扫频效果最佳。在随机扫频超声模式下,筛选出的最佳超声预处理工艺参数为:温度50℃、料液浓度40 g/L、预处理时间20 min和pH 8.5,与无超声预处理的对照组比较,酶解60 min可使水解度和ACE抑制率分别提高8.17%和16.35%,酶解物分子量大于2000 Da的含量降低 44.73%,而 200-1000 Da 的含量提高 22.57%。(3)研究了随机扫频超声预处理大米蛋白与酶解产物ACE抑制率的构效关系。适当的超声预处理使大米蛋白巯基含量增加、二硫键含量降低、表面疏水性增加、二级结构中的α-螺旋显著降低、β-折叠和无规则卷曲显著增加,说明超声作用使蛋白质结构伸展,暴露更多的疏水基团和酶切位点,有助于强化酶解效果、提高ACE抑制率。并以蛋白质的结构特征为自变量、ACE抑制率为因变量进行皮尔逊相关性分析、主成分分析和逐步线性回归分析。分析结果表明:巯基含量、表面疏水性和无规则卷曲的增加,以及二硫键含量和α-螺旋的降低是造成ACE抑制率提高的主要原因;ACE抑制率与蛋白质结构特征中的表面疏水性存在线性定量关系,得到的回归方程为:Y=6.200+0.113X3(Y为ACE抑制率,X3为表面疏水性,相关系数为0.868),方程的拟合度较高,可以用于定量分析。(4)研究了大米蛋白酶解过程中的近红外光谱原位监测方法。通过比较14种光谱预处理方法,发现卷积平滑滤波(SGF)预处理建立的ACE抑制率定量模型的效果最好。采用偏最小二乘回归分析建立了大米蛋白酶解产物ACE抑制率定量模型,模型的校正集相关系数为0.9408、交叉验证均方根误差为3.25%,预测集的相关系数为0.9323、预测均方根误差为3.27%。所得模型的评价指标较高,可用作定量预测大米蛋白酶解产物的ACE抑制率。(5)利用传感器检测、近红外光谱原位监测与PLC控制技术,建立大米蛋白酶解过程的智能控制系统,对反应中的温度和pH参数进行检测和控制,并以获得的实时ACE抑制率为指标进行酶解终点判定和双酶酶解柔性切换应用。料液浓度分别为35、40、45 g/L的超声预处理大米蛋白溶液达到设定终点时的时长分别为84、75、99min;采用双酶酶解与单酶酶解相比,设置相同的终点阈值进行判定,酶解时长分别缩短了 30、15、27 min。
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