论文部分内容阅读
小反刍兽疫（peste des petits ruminants，PPR）是由小反刍兽疫病毒引起的一种高度接触性病毒传染病，主要感染山羊、绵羊等其他小反刍动物，其中山羊高度易感。该病的流行会给畜牧业造成了巨大经济损失。目前，小反刍兽疫没有特效的治疗药物。因此，对小反刍兽疫的预防措施的探索就显得尤为重要。现在大多数国家对该病的预防还以传统的弱毒疫苗为主，虽然这种疫苗可以诱导机体产生很强的PPRV中和抗体，但该疫苗无法从血清学上区分自然感染和疫苗株免疫的动物，给PPR的血清学调查带来困难，影响该病的流行病学研究及相关防控措施的实施；另外，PPRV与其他副黏病毒科成员一样，对温度高度敏感，该病流行地区主要集中在热带和亚热带地区，对疫苗的运输条件和保存措施都提出了更为严格的要求，增加了该病的防控成本和难度。为了从以上两个方面改善PPR疫苗，本研究以犬2型腺病毒和1型腺相关病毒作为载体，分别表达小反刍兽疫病毒糖蛋白基因H和F，构建了4株不同的重组病毒rCAV-2-PPRV-H、rCAV-2-PPRV-F、rAAV-1-PPRV-H和rAAV-1-PPRV-F。并通过动物试验，对其免疫原性和安全性进行了评价。在论文的第二篇第1章的试验中，分析两重组病毒rCAV-2-PPRV-H、rCAV-2-PPRV-F在MDCK细胞上的生长适应性，并以小鼠为模型进行了两株重组病毒的免疫试验，通过检测体液免疫和细胞免疫应答水平，来评价重组病毒在小鼠体内的免疫原性。结果表明，两重组病毒与母本病毒CAV-2的生长曲线基本一致，最高生长滴度分别为1×107.8TCID50/ml、1×107.3TCID50。以1×106TCID50的剂量免疫后，两株重组病毒rCAV-2-PPRV-H和rCAV-2-PPRV-F均能刺激小鼠产生PPRV特异性的体液免疫和细胞免疫应答。这两株重组病毒组的ELISA特异抗体水平均显著地高于对照组（P<0.05）。两株重组病毒免疫组之间相比，rCAV-2-PPRV-H免疫组抗体水平高于rCAV-2-PPRV-F组。血清中和抗体检测结果与ELISA抗体测定结果有相似的趋势，但有个别个体在加强免疫后仍未检测到中和抗体。小鼠脾淋巴细胞增殖试验结果也证明了两株重组病毒可有效刺激细胞免疫应答。rCAV-2-PPRV-H和rCAV-2-PPRV-F免疫的两组小鼠脾淋巴细胞增殖指数分别为2.39和2.45，显著地高于对照组（P<0.05）。为加快重组疫苗推向临床应用，进一步评价了重组病毒对山羊的免疫原性和安全性。在第二篇第2章的试验中，对山羊进行了免疫试验研究。在这部分试验中，共用141只山羊分别进行了重组病毒rCAV-2-PPRV-H与rCAV-2-PPRV-F之间免疫原性强弱的比较；rCAV-2-PPRV-H或rCAV-2-PPRV-F单独免疫及联合使用免疫效果的检测；两株重组病毒毒副作用的评价；以及这两株重组病毒口服效果的观察。从测得的结果看，首次免疫后3周，两株重组病毒在山羊体内表现出的免疫原性比小鼠显得更强。加强免疫后3周，两株重组病毒免疫组山羊ELISA特异抗体水平OD值分别达到1.153和0.752，中和抗体滴度分别达到125.8和62.4，显著高于对照组（P<0.05）。淋巴细胞增殖试验表明rCAV-2-PPRV-H和rCAV-2-PPRV-F在加强免疫3周后均可以刺激山羊产生PPRV特异性细胞免疫应答，其刺激指数显著高于对照组（P<0.05）。两重组病毒相比，同剂量的rCAV-2-PPRV-H诱导的PPRV中和抗体滴度要高于rCAV-2-PPRV-F。单次免疫1×107.8TCID50剂量的rCAV-2-PPRV-H足以使受试山羊抗体阳转率达到97.14%，3周后经加强免疫，受试山羊抗体阳转率提高至100%，且免疫山羊血清中PPRV中和抗体滴度可持续高于1：10一年以上。两重组病毒联合免疫与rCAV-2-PPRV-H单独免疫诱导的PPRV中和抗体滴度无显著差异。口服免疫两重组病毒rCAV-2-PPRV-H和rCAV-2-PPRV-F都未能诱导产生PPRV特异性的中和抗体。在超剂量免疫试验和整个动物免疫试验过程中，未观察到重组病毒引起的毒副作用。从动物试验的结果看，两重组病毒均具有良好的免疫原性和生物安全性，尤其rCAV-2-PPRV-H，可以作为一种有效预防小反刍兽疫并且兼备区分人为免疫和野毒株感染（DIVA）的候选疫苗株。在论文的第二篇第3章的试验中，采用1型腺相关病毒（adeno-associated irus，AAV）作为载体，分别构建了表达PPRV糖蛋白H和F的重组腺相关病毒疫苗rAAV-1-PPRV-H和rAAV-1-PPRV-F，并用构建的重组病毒进行了体外细胞转导试验和动物免疫试验。在细胞转导试验中，用Western blot检测rAAV-1-PPRV-H和rAAV-1-PPRV-F体外转导的293细胞，均检测到了PPRV H和F蛋白的表达。在动物免疫试验中，将重组病毒rAAV-1-PPRV-H和rAAV-1-PPRV-F分别于0、4周以肌肉注射的方式对C57BL/6小鼠进行初免和加强免疫。用ELISA和病毒中和试验检测免疫小鼠血清中PPRV特异性抗体水平，用ELISpot方法检测小鼠淋巴细胞PPRV特异性细胞免疫应答水平。结果显示，两株重组病毒均可以刺激机体产生PPRV特异性体液免疫和细胞免疫应答，两试验组小鼠的体液和细胞免疫指标水平均显著高于对照组（P<0.05）。并且，rAAV-1-PPRV-H组体液免疫水平高于rAAV-1-PPRV-F组（P<0.05），而两重组病毒在小鼠体内诱导细胞免疫应答的水平差异不显著。综上所述，本研究较系统地探索了犬2型腺病毒和腺相关病毒载体在小反刍兽疫重组疫苗中的应用，为小反刍兽疫重组疫苗的研制提供了重要的技术依据。