研究背景:骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是严重影响青壮年身心健康的最常见的原发恶性骨肿瘤。化疗耐药(尤其是多药耐药)是导致骨肉瘤治疗失败的主要因素。因此,探寻逆转耐药治疗手段具有重要意义。研究表明肿瘤微环境及多种信号通路参与肿瘤耐药的发生。乏氧微环境是影响肿瘤发生发展的重要因素。乏氧诱导因子-1(Hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是细胞乏氧条件下调控基因表达的关键核转录因子。HIF-1α是HIF-1的活性功能亚基,与HIF-1稳定性密切相关。HIF-1α蛋白在肿瘤组织局部缺氧条件下表达明显增加,其调控下游靶基因转录,并产生相应的肿瘤生物学效应。有研究表明,乏氧可诱导多种肿瘤化疗耐药。Notch信号转导通路广泛参与对机体正常细胞的存活、分化和凋亡等重要生理过程的调控,由Notch受体、Notch配体及细胞效应器组成。Notch在多种肿瘤中存在明显的异常表达,与肿瘤发生发展密切相关,并参与肿瘤细胞的增殖、凋亡及耐药。新近研究发现乏氧与Notch通路存在相互作用,参与多种肿瘤的发生发展,且是影响肿瘤生长及化疗耐药的关键因素。第一部分HIF-1α、Notch1、MDR1/P-gp和MRP1在人骨肉瘤组织及细胞系中的表达及相关性研究研究目的:检测HIF-1α、Notch1、MDR1/P-gp、MRP1在人骨肉瘤标本组织及经典细胞系MG-63中的表达情况并对四种蛋白在组织中表达进行相关性分析,为后续研究HIF-1α、Notch1、MDR1/P-gp、MRP1在骨肉瘤发病及进展中的相互作用提供理论基础。研究方法:1.免疫组织化学方法检测HIF-1α、Notch1、MDR1/P-gp、MRP1蛋白在骨肉瘤和骨软骨瘤临床标本组织中的表达情况。2.对HIF-1α、Notch1、MDR1/P-gp、MRP1蛋白在骨肉瘤临床标本组织中表达的相关性进行统计学分析。3.RT-PCR方法检测人经典骨肉瘤细胞系MG-63中HIF-1α、Notch1、MDR1/P-gp、MRP1 mRNA的表达水平。研究结果:1.免疫组织化学染色结果显示骨肉瘤组织HIF-1α阳性率为83.3%,骨软骨瘤对照组为25%,两者之间差异有显著性(P<0.01);骨肉瘤组织Notch1阳性率为77.8%,对照组为21.4%,两者之间差异有显著性(P<0.01);骨肉瘤组织MDR1/P-gp蛋白阳性率为44.4%,对照组为14.3%,两者之间有统计学差异(P<0.05);骨肉瘤组织MRP1阳性率为69.4%,对照组为28.6%,两者之间差异有显著性(P<0.01)。结果显示,在骨肉瘤标本组织中HIF-1α、Notch1、MDR1/P-gp、MRP1蛋白的阳性表达率均高于骨软骨瘤组织。2.HIF-1α、Notch1、MDR1/P-gp、MRP1蛋白在骨肉瘤临床标本中表达的相关性进行Spearman秩相关统计分析,发现HIF-1α与Notch1表达之间、Notch1与MRP1表达之间以及HIF-1α与MRP1表达之间存在显著正相关,MDR1/P-gp与其他三种蛋白HIF-1α、Notch1及MRP1的表达之间均未显示明显相关性。3.对人经典骨肉瘤细胞系MG-63中的HIF-1α、Notch1、MDR1/P-gp、MRP1 mRNA水平的表达进行检测后发现,Notch1在MG-63细胞中存在较高表达,MRP1表达较弱,而HIF-1α和MDR1/P-gp中度表达。结论:1.HIF-1α、Notch1、MDR1/P-gp、MRP1蛋白在骨肉瘤和骨软骨瘤组织中表达有统计学差异,骨肉瘤组织中四种蛋白的阳性表达率高于骨软骨瘤。2.骨肉瘤组织中HIF-1α与Notch1、MRP1与Notch1、MRP1与HIF-1α蛋白表达之间均存在显著正相关,MDR1/P-gp与其他三种蛋白HIF-1α、Notch1及MRP1的表达之间均未显示相关性,提示HIF-1α、Notch1、MRP1在骨肉瘤发病及进展中的可能存在相互联系。3.在人经典骨肉瘤细胞系MG-63中,HIF-1α、Notch1、MDR1/P-gp、MRP1基因均有表达。第二部分乏氧环境下Notch信号通路在骨肉瘤细胞耐药中的作用及机制研究研究目的:探讨乏氧对骨肉瘤细胞增殖、周期及耐药的影响;检测乏氧环境下骨肉瘤细胞HIF-1α、Notch1、MDR1/P-gp和MRP1蛋白表达变化;通过下调Notch1阐明乏氧和Notch通路在骨肉瘤细胞耐药中的作用及其机制。研究方法:1.MTT方法检测乏氧对骨肉瘤细胞系MG-63细胞增殖的影响:取指数生长期骨肉瘤MG-63细胞,接种于96孔细胞培养板中,分别置于常氧及乏氧环境(1%02,94%N2,5%Co2)下培养 12h、24h、48h、72h,利用 MTT 实验方法检测乏氧对骨肉瘤细胞增殖的影响情况。2.流式细胞术检测乏氧对骨肉瘤细胞系MG-63细胞周期的影响:在乏氧环境下培养MG-63细胞48 h,PI染色后利用流式细胞仪检测细胞周期的变化。3.MTT方法检测乏氧对骨肉瘤MG-63细胞化疗药物敏感性的影响:取MG-63细胞分别在常氧和乏氧条件下培养24 h,然后加用不同浓度顺铂(0～80 μM)、阿霉素(0～5 μM)、甲氨蝶呤(0～5 μM)或异环磷酰胺(0～12 μg/ml)在常氧和乏氧环境下孵育24 h,MTT方法检测细胞增殖情况,并进行化疗的敏感性分析。4.Western blot检测相关蛋白表达情况:在乏氧与常氧环境下培养MG-63细胞,提取细胞总蛋白,Western blot 检测 HIF-1α、Notch1、MDR1/P-gp、MRP1蛋白的表达情况。5.MTT方法检测siRNA介导的Notch1下调对乏氧环境下骨肉瘤细胞增殖的影响:在乏氧环境中,骨肉瘤细胞转染siRNA片段,利用siRNA介导下调Notch1,采用MTT方法检测12 h、24 h、48 h和72 h骨肉瘤细胞增殖变化。6.流式细胞术检测乏氧环境中下调Notch1对骨肉瘤细胞周期及凋亡影响:在乏氧环境中,骨肉瘤细胞转染siRNA片段,通过siRNA介导的下调Notch1,PI染色后利用流式细胞仪检测细胞周期的变化及细胞凋亡情况。7.MTT方法检测乏氧环境下阻断Notch1对骨肉瘤细胞药物敏感性的影响:骨肉瘤MG-63细胞在乏氧环境中培养24 h,次日转染Notch1 siRNA片段,继续置入乏氧环境下孵育24 h,经不同浓度的顺铂(0～80 μM)、阿霉素(0～5 μM)、甲氨蝶呤(0～5μM)或异环磷酰胺(0～12μg/ml)处理后置于乏氧环境下培养24 h后进行MTT检测。8.Western blot实验检测下调Notch1对乏氧环境下骨肉瘤细胞相关蛋白表达的影响:利用Notch1 siRNA阻断乏氧下MG-63细胞的Notch1表达,置于乏氧环境下培养48 h,采用Western blot实验检测相关蛋白表达情况。研究结果:1.MTT结果显示乏氧可促进MG-63细胞增殖,24 h、48 h、72 h分别与对应常氧组比较,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.05)。其中,与常氧对照组相比,乏氧48 h对细胞增殖的作用可见明显差异(P<0.01),结果表明乏氧48 h时对MG-63促增殖作用较强。2.采用流式细胞术检测骨肉瘤细胞乏氧培养48 h的细胞周期,结果显示乏氧组骨肉瘤细胞G0/G1期细胞比例为41.79%±3.25%,常氧组G0/G1期细胞比例为53.87%±2.31%,两者相比有统计学差异(P<0.01)。表明乏氧通过调控细胞周期促进骨肉瘤细胞增殖。3.MTT实验结果显示将MG-63细胞分别在常氧和乏氧条件下培养24 h,然后用顺铂(0～80 μM)、阿霉素(0～5 μM)、甲氨蝶呤(0～5 μM)或异环磷酰胺(0～12 μg/ml)在常氧和乏氧条件下24小时进行化疗的敏感性分析。乏氧条件下骨肉瘤MG-63细胞对不同化疗药物耐药性显著提高。同时,乏氧组骨肉瘤MG-63细胞对顺铂、阿霉素、甲氨蝶呤或异环磷酰胺的半数抑制浓度IC50分别为42.55±1.62μM、3.13±0.08μM、3.05±0.07μM、8.18±0.04μg/ml,常氧组骨肉瘤MG-63细胞对四种化疗药物的半数抑制浓度IC50分别为59.63±1.49μM、3.97±0.03μM,3.98±0.03μM、9.97±0.07μg/ml。乏氧与常氧组MG-63细胞对顺铂、阿霉素、甲氨蝶呤或异环磷酰胺的半数抑制浓度IC50相比,有统计学差异(P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.01)。4.Western blot实验检测乏氧环境骨肉瘤细胞相关蛋白表达,发现乏氧组细胞HIF-1α、Notch1-ICN和MRP1蛋白表达升高,MDR1/P-gp蛋白表达无明显差异。结果表明乏氧激活Notch信号通路,并对骨肉瘤细胞MRP1具有上调作用。5.MTT实验结果显示乏氧干扰组细胞与乏氧干扰对照组相比,骨肉瘤细胞增殖降低,48 h后细胞增殖显著降低(P<0.01),而乏氧干扰对照组和乏氧组无明显统计学差异。乏氧可能通过上调Notch1表达促进骨肉瘤细胞增殖。。6.流式细胞术检测乏氧下调Notch1后骨肉瘤细胞周期分布。结果显示,下调Notch1可以导致乏氧干扰组Go/G1期比例较乏氧组和乏氧干扰对照组升高。乏氧干扰组较乏氧干扰对照组出现17.53%的细胞凋亡。下调Notch1可以导致乏氧干扰组Go/G1期比例较乏氧组和乏氧干扰对照组升高。7.为了明确阻断Notch1对乏氧环境骨肉瘤细胞化疗耐药的影响,MG-63细胞在乏氧环境下培养24 h,经siRNA下调Notch1表达后置入乏氧环境下继续孵育24 h,再经不同药物及浓度处理后置于乏氧环境下培养24 h进行MTT检测。结果表明,siRNA介导的Notch1下调可以导致乏氧环境下骨肉瘤细胞对顺铂、阿霉素、甲氨蝶呤或异环磷酰胺的药物敏感性增强,通过下调Notch1可以逆转乏氧环境中骨肉瘤细胞耐药。同时,乏氧干扰组骨肉瘤MG-63细胞对顺铂、阿霉素、甲氨蝶呤或异环磷酰胺的半数抑制浓度IC50分别为33.39±1.62 μM、2.72±0.02 μM、2.01±0.10 μM、5.79±0.15 μg/ml,乏氧干扰对照组骨肉瘤MG-63细胞对四种化疗药物的半数抑制浓度IC50分别为58.08±3.49 μM,4.18±0.07μM,3.94±0.12μM,9.61±0.98μg/ml。乏氧干扰组与乏氧干扰对照组MG-63细胞对顺铂、阿霉素、甲氨蝶呤或异环磷酰胺的半数抑制浓度IC50相比,有统计学差异(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05)。8.为了明确乏氧环境下MG-63细胞MRP1蛋白是否受Notch通路的调控,利用Notch1 siRNA下调MG-63细胞Notch1表达,置于乏氧环境下培养48 h。采用Western blot实验方法检测蛋白表达,结果显示下调Notchl后乏氧干扰组细胞Notch1-ICN和MRP1蛋白表达水平降低(P<0.01)。乏氧干扰组和乏氧干扰对照组MDR1/P-gp蛋白表达水平无明显差异。结论:1.乏氧通过调控细胞周期促进骨肉瘤细胞增殖。下调Notch1表达,骨肉瘤Go/G1期细胞增多,可降低骨肉瘤细胞增殖。2.乏氧诱导骨肉瘤细胞耐药。下调Notch1可促进乏氧环境下骨肉瘤细胞出现凋亡,并逆转乏氧诱导的骨肉瘤细胞耐药。3.乏氧环境下骨肉瘤细胞MRP1蛋白表达增高,下调Notch1可通过降低MRP1蛋白表达,逆转乏氧诱导的骨肉瘤细胞多药耐药。4.提示Notch1是治疗骨肉瘤耐药的有效分子靶点。