溴代阻燃剂(Brominated Flame Retardants,BFRs)是一种应用量较大的化学品,广泛用于印刷电路板及其它聚合材料的阻燃剂中,其作为环境污染物也普遍存在于各种非生物和生物介质中。其中最为典型的BFRs为四溴双酚A(Tetrabrobisphenol A,TBBPA)和多溴联苯醚(Poly Brominated Diphenyl Ethers,PBDEs)。目前,对于TBBPA和PBDEs作用于人体的器官组织毒性有了大量的研究,然而,关于TBBPA和PBDEs对人体呼吸系统毒性研究仍然有限。因此,本研究以TBBPA和BDE209作为BFRs的典型代表,采用人体支气管细胞Beas2B和肺上皮细胞16HBE以及人体血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)作为研究对象,分别从细胞和蛋白两个层面开展了TBBPA和BDE209对人体的呼吸暴露毒性研究。(1)首先从细胞的层面研究了TBBPA对人体呼吸系统细胞Beas2B和16HBE的毒性损伤作用。结果显示,随着TBBPA的暴露浓度从0增加至50μM,两种细胞的存活率均逐渐下降,细胞通透性不断提高。这说明越高浓度的TBBPA对细胞的活力及结构产生更为严重的损伤作用。此外,流式细胞仪分析也表明了细胞在暴露后出现了部分凋亡,且随着浓度的提高,凋亡率也随之提高。然而,在高浓度的刺激下,大多数细胞会直接进入到死亡阶段而没有出现凋亡的过程。进一步,通过基因表达测定分析发现与细胞凋亡相关基因p53、Survivin、bax、bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的表达量均出现不同程度的上调,其中24小时的暴露相较于12小时会激发更为强烈的表达上调。两种呼吸系统细胞的Caspase-3、Survivin基因在受到不同浓度的TBBPA暴露刺激后均出现了急剧的表达上调(2～9倍),Caspase-9、bcl-2、bax基因出现了轻微的表达上调(1～6倍),p53基因表达趋于稳定。根据Caspase-9、Caspase-3、bcl-2、bax这四个基因表达的上调,可以推测细胞凋亡的线粒体通路可能被激活。除此之外,bcl-2和bax作为一对相互拮抗的基因,均表现出了相同的表达趋势。一方面bcl-2可以抑制细胞凋亡的进行,与此同时bax的表达也在抑制bcl-2的作用,这表明细胞受到刺激后发生的凋亡也是其细胞内部平衡变化的结果。此外,对暴露过程中细胞胞内活性氧(ROSs)组分、抗氧化性酶SOD和CAT活力进行了测定,结果显示:两种细胞内的ROSs组分和抗氧化性酶的活性均出现明显的提高,表明细胞在TBBPA暴露过程中受到了一定的氧化损伤并出现了氧化应激。进一步,通过对比研究发现Beas2B细胞相较于16HBE细胞对TBBPA具有更强的耐受性。(2)进一步,从蛋白的层面揭示人体HSA受到TBBPA和BDE209的暴露后出现的构型及其潜在的功能影响。光谱实验研究表明,TBBPA、BDE209均能诱导HSA构象变化,HSA的α螺旋含量下降,二级结构变得不稳定,且Trp残基周围疏水性增加。这表明TBBPA和BDE209具有潜在的蛋白毒性作用,可能会导致相关蛋白的功能损伤。其中TBBPA比BDE209的作用要更为显著。此外,对于TBBPA和BDE209与HSA蛋白存在的结合位点进行了理论计算分析,TBBPA在HSA的结合位点附近的氨基酸为ARG484、LEU481、GLU450、VAL344、TRP214、LYS199和LEU198氨基酸残基。BDE209在HSA的结合位点附近的氨基酸为HIS288、ARG257、CYS245、HIS242、LYS199、GLN196、GLU153、TYR150。基于结合位点的结果对TBBPA和BDE209与HSA的相互作用进行了理论计算分析,结果表明与实验结果呈现一致,BDE209的结合能(-ΔG结合为6.35 kcal/mol)要低于TBBPA(-ΔG结合为6.78 kcal/mol)。其可能的原因是BDE209没有用于形成氢键的H原子且分子量更大疏水性更强,而TBBPA含有多个H原子且分子量较小、疏水性较弱。因此,TBBPA更容易与HSA蛋白结合,这也与实验结果表现出一致,其中TBBPA能够对蛋白造成更为显著的影响。综上所述,本论文从细胞和蛋白两个层面研究了典型溴代阻燃剂对人体呼吸系统产生的一系列毒性和损伤作用。在受到TBBPA的暴露刺激后,人呼吸系统相关细胞会受到明显的毒性刺激,导致细胞出现过氧化以及胞内氧化应激,并诱导细胞凋亡。此外,在损伤的过程中,细胞的通透性也会增大,增加细胞内物质和污染物的接触风险。并且,TBBPA和BDE209还会与HSA进行相互结合,直接影响蛋白在结构和功能上的变化。本研究揭示了典型溴代阻燃剂对于人体存在的呼吸暴露风险,并为典型毒害污染物对人体呼吸道的暴露和毒害作用机制的研究提供一定的借鉴意义。