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随着纳米科技的快速发展,纳米材料在材料、工程、医学等领域有越来越广泛的应用。量子点(Quantum Dots,QDs)作为新型的纳米材料,具有良好的荧光特性,被用于生物检测和生物成像。传统半导体量子点一般由Ⅲ~Ⅴ族或Ⅱ~Ⅵ族化学元素组成,直径在1nm至10nm之间,因其组成中含有金属元素,毒性一般较大,限制了其应用。碳点(Carbon dots,CDs)作为一种新型的荧光量子点,不仅具有良好的荧光特性,且具有水溶性好、毒性低、成本低、生物相容性好等诸多优点,在体内成像、靶向诊断和药物载体等方面有着很大的应用前景。CDs在医学应用领域表现出巨大潜力的同时,其生物安全性受到重视。已有体内研究表明,进入小鼠体内的CDs主要分布在肝脏、肠和脑组织中,未引起显著的肝损伤。体外研究显示,CDs可引起MC3T3-E1细胞存活率降低和细胞功能障碍等,导致细胞凋亡等毒性效应。然而,目前有关CDs安全性与毒性的研究较少,其毒性特征及毒作用机制也不清楚,有待开展系统研究。据此,本研究选择小鼠肝巨噬细胞系(KUP5细胞)、小鼠正常肝细胞系(AML12细胞)和小鼠肝癌细胞系(Hepa1-6细胞)作为体外毒性研究模型。研究CDs对三种肝细胞的毒性效应和机制,初步探讨CDs引起三种肝细胞的自噬和凋亡以及ROS在其中的作用,后续进一步分析了CDs诱导的溶酶体损伤及机制,为CDs的肝毒性研究提供科学依据。研究结果如下:(1)本研究选用的CDs由本校化学化工学院合作课题组成员制备,CDs的最大激发和发射波长分别为332nm和440nm,CDs除了保留基于七嗪的初级单元外,一些含氧基团在CDs表面上官能化;粒径为3.06±0.45nm,在完全培养基中的水合粒径为5.32±0.38nm,Zeta电位是-15.44±0.56mV。CDs的水溶性和分散性都较好,符合实验要求。(2)CDs处理KUP5细胞、AML12细胞和Hepa1-6细胞24h后,KUP5细胞和AML12细胞存活率显著降低,Hepa1-6细胞存活率略有降低。说明CDs对KUP5细胞和AML12细胞的毒性效应较显著,对Hepa1-6细胞的毒性效应不显著。细胞存活率与暴露剂量之间具有明显的剂量效应关系,后续ATP、LDH和细胞形态学实验结果与MTT结果一致。(3)CDs可诱导KUP5细胞、AML12细胞和Hepa1-6细胞自噬和凋亡的发生以及ROS的过量产生,三种肝细胞在CDs染毒12h时可引起LC3-Ⅱ表达水平明显升高,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对表达水平也明显升高,说明三种肝细胞已经发生自噬。3-MA预处理后,KUP5细胞和AML12细胞存活率升高,说明自噬的发生加剧了CDs诱导的细胞毒性,Hepa1-6细胞存活率基本无变化,自噬的作用有待进一步分析。与单独CDs组相比,3-MA预处理组三种肝细胞内Cleaved Caspase3表达水平显著降低;Ac-DEVD-CHO预处理组中三种肝细胞内LC3Ⅱ或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达水平显著降低,说明CDs诱导的肝细胞自噬和凋亡应是相互调控的关系。NAC(ROS清除剂)预处理肝细胞后,三种肝细胞生存率均升高,说明ROS的生成加剧了细胞毒性;与400μg/ml组相比,400μg/ml+NAC组KUP5细胞内Cleaved Caspase3表达水平略有升高,凋亡率增加,AML12细胞和Hepa1-6细胞内Cleaved Caspase3表达水平略有降低,凋亡率降低;三种肝细胞内LC3-Ⅱ表达水平略有升高,细胞自噬水平升高,但KUP5细胞和Hepa1-6细胞内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对表达水平明显升高,在AML12细胞内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对表达水平明显下降。(4)CDs处理三种肝细胞3h时已经诱导肝细胞自噬的发生,三种肝细胞摄取的CDs蓄积在溶酶体引起溶酶体膜受损和数目减少。此外,CDs还诱导三种肝细胞TFEB核转位的发生,KUP5细胞内CDs诱导的TFEB核转位为mTOR非依赖的,而ERK通路未被激活;AML12细胞和Hepa1-6细胞内CDs诱导的TFEB核转位为mTOR和ERK通路协同参与的。综上所述,CDs对KUP5细胞、AML12细胞和Hepa1-6细胞均可产生明显的毒性作用,并且对KUP5细胞和AML12细胞的细胞毒性大于Hepa1-6细胞。CDs诱导三种肝细胞氧化应激、细胞自噬和细胞凋亡的发生,氧化应激和细胞凋亡导致肝细胞死亡率升高,细胞自噬促进KUP5细胞和AML12细胞的死亡,却未引起Hepa1-6细胞死亡率升高。与此同时,CDs诱导的溶酶体损伤参与了其诱导的自噬过程,这一过程在三种类型的肝细胞中为mTOR和ERK通路协同或分别参与发生。本文通过阐明活性氧和溶酶体在参与CDs诱导的细胞损伤中的作用及调控机制,为全面认识CDs的毒性和进一步开展CDs毒性研究拓宽思路。