【摘 要】
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背景:原发性肝癌具有较高的发病率,研究发现与化学致癌物刺激、遗传因素、基因突变、病毒性肝癌、水土因素以及酒精性肝硬化因素有关。我国传统中药是近年肝癌治疗的研究热点,姜黄根部提取的姜黄素毒性极小,具有抑制癌症的功效,但关于姜黄素抗肝癌的作用机制尚不完全明确。Bcl-2 相关转录因子 1（BCL-2 associated transcription factor 1,Bclafl）,是一种多功能蛋白质
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背景:原发性肝癌具有较高的发病率,研究发现与化学致癌物刺激、遗传因素、基因突变、病毒性肝癌、水土因素以及酒精性肝硬化因素有关。我国传统中药是近年肝癌治疗的研究热点,姜黄根部提取的姜黄素毒性极小,具有抑制癌症的功效,但关于姜黄素抗肝癌的作用机制尚不完全明确。Bcl-2 相关转录因子 1（BCL-2 associated transcription factor 1,Bclafl）,是一种多功能蛋白质,在基因转录以及转录后加工时发挥重要作用,Bclaf1蛋白在肝癌组织蛋白质组学分析中呈高表达,对肝癌细胞的增殖过程起到调节和抑制作用,有利于加速肝癌细胞凋亡,促使自噬反应发生等。线粒体途径作为细胞凋亡的关键途径,死亡过程高度保守,主要受到相关凋亡基因的调控,通过PI3K/AKT/GSK-3β通路可以对细胞活动加以调节,改变其生长和增殖过程。当该通路被过度激活会使细胞受到强烈刺激引起增殖活动异常,即肿瘤发生。因此,本研究推测姜黄素可能通过Bclaf1介导PI3K/AKT/GSK-3β通路诱导人肝癌细胞凋亡是通过线粒体途径实现的。目的:通过体外与体内实验探讨姜黄素介导Bclaf1通过PI3K/AKT/GSK-3β通路诱导人肝癌细胞凋亡线粒体途径的作用机制。方法:体外实验:采用CCK-8实验检测不同浓度姜黄素（10,20,40,60μM）和5FU（10 μM）对人肝癌细胞HepG2与SK-Hep-1增殖的作用;采用PI单染法检测姜黄素对人肝癌细胞HepG2和SK-Hep-1细胞周期的作用;采用Hoechst33258染色法以及Annexin/PI双染法检测姜黄素对人肝癌细胞的凋亡作用;采用荧光探针法检测姜黄素对人肝癌细胞线粒体膜电位的作用;采用Western blot法对PI3K/AKT/GSK-3β通路相关蛋白、凋亡相关蛋白以及Bclaf1的表达量进行检测,加入通路抑制剂LY294002,验证姜黄素作用人肝癌细胞后对PI3K/AKT/GSK-3β通路的作用;采用CRISPR/Cas9技术将人肝癌细胞HepG2与SK-Hep-1的Bclaf1基因进行敲除,利用Annexin/PI双染法、PI单染法、荧光探针法检测姜黄素对敲除Bclaf1的人肝癌细胞线粒体途径的作用;采用Western blot法检测姜黄素对敲除Bclaf1的人肝癌细胞线粒体途径蛋白与PI3K/AKT/GSK-3β通路相关蛋白的表达,验证Bclaf1参与PI3K/AKT/GSK-3β通路介导的人肝癌细胞线粒体途径的作用机制。体内实验:构建人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤模型,分为阴性对照组、阳性对照组（5FU）、姜黄素（20μM）组、姜黄素（40 μM）组、姜黄素（60 μM）组,通过计算瘤体积与生长抑制率检测姜黄素对裸鼠移植瘤的抑制作用;采用H＆E染色观察裸鼠移植瘤组织结构;采用免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤组织中Bcl-2、Bax和Bclaf1的表达情况;Western blot法检测移植瘤组织凋亡蛋白和PI3K/AKT/GSK-3β通路相关蛋白的表达情况。结果:CCK-8法实验结果显示姜黄素能够对人肝癌细胞HepG2以及SK-Hep-1的增殖过程起到抑制作用,并且抑制效果与时间和浓度具有依赖性;PI单染法结果显示人肝癌细胞阻滞在G0/G1期;Hoechst33258染色法、Annexin/PI双染法实验结果发现姜黄素促进人肝癌细胞凋亡,且随姜黄素浓度升高凋亡率逐渐增加;荧光探针法检测结果发现姜黄素作用后线粒体膜电位下降;Western blot法检测发现凋亡相关蛋白与线粒体途径相关蛋白:Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Cyt-c上调,Bcl-2/Bax下调,姜黄素抑制通路相关蛋白PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β的表达,加入通路抑制剂LY294002后能够增强姜黄素对通路的抑制作用,Bcl-2/Bax下调;根据Western blot法的检测能够看出,姜黄素抑制Bclaf1蛋白的表达;构建稳定敲除Bclaf1基因后的HepG2和SK-Hep-1细胞,发现姜黄素作用后细胞凋亡率大幅提高,阻滞在G0/G1期的细胞数量显著增加,Bcl-2/Bax、PI3K/AKT/GSK-3β通路相关蛋白表达下调,Cyt-c表达量上调;构建人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤模型,实验结果显示姜黄素抑制裸鼠移植瘤生长;H＆E染色观察到姜黄素破坏了移植瘤组织结构;免疫组织化学与Western blot结果显示姜黄素抑制了移植瘤组织中Bclafl、Bcl-2和通路相关蛋白的表达,Bax表达量增多。结论:姜黄素可以通过线粒体途径诱导人肝癌细胞凋亡,其作用机制与其抑制Bclaf1蛋白的表达,抑制PI3K/AKT/GSK-3β通路有关。
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