雄性生殖系干细胞是一群具有高度自我更新能力和分化潜能的细胞,它能向子代传递遗传信息,是雄性成体内唯一可复制的二倍体永生细胞。转基因技术与雄性生殖系干细胞异体及异种移植技术相结合,将会为克隆动物、转基因动物生产及一些人类遗传性疾病的基因治疗提供新的机遇与途径,在医学、畜牧业生产等领域有着广阔的应用前景。本试验采用组合酶消化和选择贴壁法,对5月龄、6月龄牛胎儿及新生牛雄性生殖系干细胞分离、培养及冷冻保存进行了研究,以期为后续转基因动物研究提供依据,结果如下:1.牛睾丸支持细胞分离纯化后进行体外培养。结果显示:这一阶段牛睾丸适宜支持细胞分离纯化用;采用0.25 %胰蛋白酶+0.02 %EDTA二次消化法是一种经济有效的牛胎儿睾丸支持细胞分离方案;试验发现,牛胎儿睾丸支持细胞体外研究时间应控制在3天～20天内,处于对数生长期的牛胎儿睾丸支持细胞,对牛体外受精卵体外发育有明显的促进作用。2.牛雄性生殖系干细胞分离纯化后与睾丸支持细胞共培养。结果显示:睾丸支持细胞对雄性生殖系干细胞体外增殖、分化是必需的,同时对数期睾丸支持细胞对雄性生殖系干细胞贴壁、增殖与分化效果明显;共培养16天后,牛雄性生殖系干细胞成功分化为长形精子细胞,试验初步建立了牛雄性生殖系干细胞体外诱导培养分化体系。3.牛雄性生殖系干细胞分离纯化后,进行冷藏、冷冻保存研究。结果显示:牛胎儿睾丸4℃低温保存的上限时间为48h;牛胚胎程序化冷冻、精液冷冻及胚胎玻璃化冷冻保存方案,不适于雄性生殖系干细胞的冷冻保存;雄性生殖系干细胞冷冻保存方案参照常规细胞冷冻保存方案,雄性生殖系干细胞分离提纯后单独冷冻保存效果较好。