研究背景:高血压肾病、糖尿病肾病等继发性肾脏疾病的发病率逐年增多[1],且随着慢性肾小球肾炎等原发性肾脏疾病的进展,最终引起肾脏功能不可逆衰退的终末阶段,我们称之为终末期肾脏病(End-Stage Renal Disease,ESRD)。而ESRD患者只能依赖肾移植、血液透析或腹膜透析等肾脏替代治疗方式维持生命,生存率、生活质量严重下降,同时也增加家庭、社会以及国家的负担[2],且该疾病具有预后差、花费高、耗时长等特点,在全球范围内严重危害人类的健康。由于肾移植受肾源的影响,绝大部分ESRD患者只能靠血液透析或腹膜透析维持生命,血液透析治疗或腹膜透析治疗虽延长了ESRD患者的生存时间,但其急性并发症、慢性并发症严重威胁了ESRD患者的生命,特别是心血管疾病(Cardiovascular Diseases,CVD)并发症。国内外研究表明,超过50%的ESRD患者的最终死因为CVD[3],导致CVD发病率与死亡率增加的一个重要的原因就是血管钙化(Vascular Calcification,VC)[4]。VC在ESRD患者中非常普遍,ESRD患者一旦进入血液透析治疗或是腹膜透析治疗,VC的进展就会加速,而且VC的存在和程度可作为心血管事件发生以及死亡的最有力的独立预测因子[5]。对于ESRD患者,引起VC的始动因素为钙磷代谢的失衡[6],VC的发生受多种因素的调控,其关键的因素为血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)向成骨细胞发生转分化[7]。促进VMSCs向成骨细胞发生转分化的危险因素之一就是高磷[8]。ESRD患者的慢性并发症中高磷血症非常常见,因此研究高磷血症与VC的机制非常有临床意义。有研究表明,成纤维细胞生长因子23(Fibroblast Growth Factor 23,FGF23)与VC密切相关[9],但是FGF23在VC中是否作为一个标志物,以及在VC中作为抑制因素或促进因素存在,目前尚无定论。在非慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease,CKD)或CKD早期,FGF23升高增加尿磷排泄,抑制维生素D、甲状旁腺激素(Parathyroid Hormone,PTH)代谢,维持体内钙磷代谢平衡,显示出对心血管的保护作用。但是随着CKD病情恶化,进展到ESRD阶段,伴随肾小球滤过率(Glomerular Filtration Rate,GFR)的下降,肾脏表达Klotho明显减少。CKD患者VC与Klotho缺乏状态直接相关,Klotho是VC的抑制因子,ESRD患者的机体对FGF23呈现一种抵抗状态,FGF23对钙磷的调节作用减弱甚至消失,导致机体钙磷代谢紊乱,加上继发性甲状旁腺机能亢进以及维生素D缺乏的不良反应,机体对于骨矿物质的代谢呈现整体失衡的状态,一系列的紊乱及失衡促进VC的发生和发展。结合已有的文献报道Wnt/β-catenin信号通路的活化促进了VMSCs的成骨分化与钙化过程[10]。然而,关于Klotho/FGF23轴是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路中的相关信号分子,进而介导VMSCs的成骨分化与钙化,尚未见研究报道,因此本研究首先拟采用β-磷酸甘油酯(β-glycerol phosphate,β-GP)体外诱导VMSCs钙化,探讨Klotho/FGF23对其钙化的影响及其可能机制。长链非编码RNA(lnc RNA)定义为转录的RNA分子家族,具有200个以上的核苷酸,但没有蛋白质编码能力,与生物学发展、细胞生理学和各种疾病的进展相关[11]。lnc RNA的主要工作机制是与多种蛋白质和micro RNA(mi RNA)相互作用。据报道,小核仁RNA宿主基因29(Small Nucleolar RNA Host Gene 29,SNHG29)参与骨肉瘤、结直肠癌的发生[12]。有研究表明SNHG29减弱了VMSCs的钙化并降低了成骨相关因子的表达,是血管钙化的负调节剂。但是,没有提供有关特定调节机制的信息。因此,尚不清楚SNHG29在VC中的作用。mi R-200b-3p参与了不同疾病(如肺腺癌、胰腺癌、前列腺癌等)中的多种调控机制[13,14]。最近,Kong证实在退化性动脉粥样硬化的动脉中存在高度表达的mi R-200b-3p[15]。但mi R-200b-3p在VMSCs中的作用不明确。我们采用生物学信息软件Starbase进行预测发现Lnc RNA-SNHG29与mi R-200b-3p具有可结合区域,同时mi R-200b-3p与α-Klotho也具有可结合区域,且有研究发现Lnc RNA-SNHG29在钙化的VMSCs中表达下调,作为VC的负调节因子。另外,在高磷酸盐诱导的大鼠主动脉外植体钙化中,mi R-200c表达上调;在主动脉瓣钙化导致的主动脉狭窄疾病中,mi R-200b表达上调,但其在VMSCs钙化中的具体分子作用机制目前尚不清楚,以上均提示lnc RNA在VC中起着重要作用,但Lnc RNA-SNHG29在VC中的具体作用机制不清楚。结合查阅相关文献及生物学信息软件Starbase的预测分析,我们推测Lnc RNA-SNHG29通过靶向下调mi R-200-3p激活α-Klotho介导的信号通路参与VMSCs的钙化,因此,本研究在探讨Klotho/FGF23对其钙化的影响及其可能机制后,拟进行深入研究Lnc RNA-SNHG29/mi R-200-3p调控Klotho/FGF23介导的血管钙化的机制研究,试图为Lnc RNA-SNHG29作为VC相关疾病的新型治疗靶点提供实验依据。第一部分:Klotho与FGF23在β-GP诱导VMSCs钙化过程中作用目的:体外培养VMSCs,采用10m Mβ-GP进行诱导,建立VMSCs钙化模型,探讨Klotho与FGF23在β-GP诱导VMSCs钙化过程中表达水平以及分别过表达Klotho和FGF23对β-GP诱导VMSCs钙化的影响。方法:1、提取大鼠胸主动脉VMSCs进行原代细胞培养,进行VMSCs鉴定后自然纯化法进行传代培养用于实验研究,采用10m Mβ-GP刺激VMSCs诱导钙化。实验分NP组与HP组,探索β-GP诱导VMSCs钙化的最佳时间;采用茜素红染色观察NP组和HP组两个实验组第0、5、9、12d细胞中的钙化情况,同时对NP组和HP组两个实验组第0、5、9、12d的细胞内钙进行测定,q RT-PCR检测NP组和HP组两个实验组中Klotho与FGF23m RNA的表达,Western blot检测NP组和HP组两个实验组中Klotho与FGF23蛋白的表达。2、构建过表达Klotho、FGF23的重组腺病毒,使用q RT-PCR及Western blot法检测方法进行过表达Klotho、FGF23基因的验证;实验分为5组:NP组、HP组、HP+Ad Laz组、HP+Ad-Klotho组、HP+Ad-FGF23组;茜素红染色检测各组细胞的钙化情况;对各实验组VMSCs进行细胞内钙含量分析并检测各实验组VMSCs细胞中碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性的情况。结果:1、β-GP诱导VMSCs促进钙化具有时间依赖性,随着时间的延长,VMSCs钙化更加明显;细胞内钙含量呈时间依赖性逐渐增多,干预第9d时VMSCs细胞内钙的含量较第0d时增多,干预第12d时VMSCs细胞内钙的含量较第0d时显著增多;考虑细胞活性及细胞钙化的需求,我们以β-GP处理VMSCs 12d作为后续实验的时间点;β-GP诱导VMSCs后,其Klotho与FGF23m RNA的表达及Klotho与FGF23蛋白的表达均下调。2、过表达VMSCs细胞的Klotho基因后,VMSCs细胞中Klothom RNA及Klotho蛋白的表达上调,过表达VMSCs细胞FGF23基因后,VMSCs细胞中FGF23m RNA及FGF23蛋白的表达上调;在β-GP诱导的VMSCs钙化过程中,过表达Klotho基因或FGF23基因后,VMSCs细胞钙化有一定程度的缓解,细胞中钙沉积下降,ALP的活性下降。结论:1、β-GP可诱导VMSCs向成骨细胞转化,促进钙化的发生。2、β-GP诱导VMSCs钙化过程中,Klotho与FGF23的表达下调。3、过表达Klotho和FGF23能减轻β-GP诱导的VMSCs细胞内钙的沉积,降低ALP的活性,抑制β-GP诱导的VMSCs发生钙化。第二部分:Klotho/FGF23调控β-GP诱导VMSCs钙化的机制目的:探讨FGF23/Klotho轴调控β-GP诱导VMSCs钙化的机制。方法:1、实验分为2组,NP组与HP组,细胞培养干预时间为12d,qRT-PCR检测NP组和HP组两个实验组中Wnt/β-catenin信号通路相关基因RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin及α-SMA m RNA的表达,Western blot检测NP组和HP组两个实验组中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin及α-SMA、Klotho、FGF23蛋白的表达。2、构建Klotho、FGF23的腺病毒过表达载体,实验分为3组,HP+Ad Laz组、HP+Ad-Klotho组、HP+Ad-FGF23组;细胞培养干预时间为12d。q RT-PCR检测HP+Ad Laz组、HP+Ad-Klotho组、HP+Ad-FGF23组3个实验组中Wnt/β-catenin信号通路相关基因RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin及α-SMA m RNA的表达,Western blot检测HP+Ad Laz组、HP+Ad-Klotho组、HP+Ad-FGF23组3个实验组中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin及α-SMA、Klotho、FGF23蛋白的表达。3、沉默Klotho、FGF23基因的表达,采用qRT-PCR检测和Western blot进行Klotho m RNA、FGF23 m RNA及Klotho、FGF23蛋白表达的进行基因沉默的验证;实验分组为7组:NP组、HP组、HP+DKK1组、HP+sh Klotho组、HP+sh FGF23组、HP+sh Klotho+DKK1组、HP+sh FGF23+DKK1组,细胞培养干预时间为12d。q RT-PCR检测7个实验组中Wnt/β-catenin信号通路相关基因RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin及α-SMA m RNA的表达,Western blot检测7个实验组中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin及α-SMA蛋白的表达。结果:1、在β-GP诱导VMSCs促进钙化的过程中,Wnt/β-catenin信号通路被激活,Wnt7b、β-catenin m RNA的表达及Wnt7b、β-catenin蛋白的表达上调,Klotho、FGF23蛋白的表达下调;VMSCs向成骨细胞转化,成骨细胞特异性标志物RUNX2、BMP9 m RNA的表达及RUNX2、BMP9蛋白的表达上调;VMSCs特异性表达标志物α-SMA m RNA的表达及α-SMA蛋白下调。2、在β-GP诱导VMSCs促进钙化的过程中,过表达Klotho基因或FGF23基因后,Wnt7b、β-catenin、RUNX2、BMP9 m RNA的表达及Wnt7b、β-catenin、RUNX2、BMP9蛋白的表达下调,α-SMA m RNA及α-SMA蛋白的表达上调。3、在β-GP诱导VMSCs促进钙化的过程中,沉默Klotho基因或FGF23基因的表达,Klothom RNA、FGF23m RNA、Klotho、FGF23蛋白的表达下调;Wnt/β-catenin信号通路被激活,Wnt7b、β-catenin m RNA及Wnt7b、β-catenin蛋白的表达上调,RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin m RNA及RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin蛋白表达上调,α-SMA m RNA及α-SMA蛋白的表达下调;予以DKK1阻断Wnt/β-catenin后,VMSCs的钙化有明显缓解,RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin m RNA及RUNX2、BMP9、Wnt7b、β-catenin蛋白表达下降,α-SMA m RNA及α-SMA蛋白的表达上调。结论:Klotho/FGF23通过Wnt/β-catenin信号通路调控β-GP诱导的VMSCs钙化。第三部分:Lnc RNA-SNHG29下调mi R-200b-3p参与Klotho/FGF23介导血管钙化的机制目的:前面两个部分的研究显示Klotho、FGF23对β-GP诱导的VMSCs钙化具有保护作用,且Klotho/FGF23通过Wnt/β-catenin信号通路调控其钙化。为深入研究Klotho/FGF23的调控机制,我们采用生物学信息软件Starbase进行预测发现Lnc RNA-SNHG29与mi R-200b-3p具有可结合区域,同时mi R-200b-3p与α-Klotho也具有可结合区域,且有研究发现Lnc RNA-SNHG29在钙化的血管平滑肌细胞中表达下调,作为VC的负调节因子。另外,在高磷酸盐诱导的大鼠主动脉外植体钙化中,mi R-200c表达上调;在主动脉瓣钙化导致的主动脉狭窄疾病中,mi R-200b表达上调,但其在血管平滑肌钙化中的具体分子作用机制目前尚不清楚,以上均提示lnc RNA在VC中起着重要作用,但Lnc RNA-SNHG29在VC中的具体作用机制不清楚。在前期研究结果的基础上结合Starbase软件预测发现,我们假设Lnc RNA-SNHG29靶向mi R-200b-3p、mi R-200b-3p靶向α-Klotho对VMSCs的钙化进行调节,本部分实验将阐明Lnc RNA-SNHG29与mi R-200b-3p的关系、mi R-200b-3p与α-Klotho的关系,及其在VMSCs钙化中的调节作用,为VC的治疗提供新策略。方法:1、采用10m Mβ-GP刺激人主动脉血管平滑肌细胞(Human aortic smooth muscle cells,HASMC)体外构建钙化模型,MTT测定干预后第0,3,6,9,12,15d HASMC的活性;采用茜素红染色观察第0,3,6,9,12,15d HASMC钙化的情况,对第0,3,6,9,12,15d HASMC的细胞内钙含量进行测定,Western blot检测第0,3,6,9,12,15d HASMC中RUNX2、BMP2、α-SMA蛋白的表达,q RT-PCR检测第0,3,6,9,12,15d HASMC中SNHG29、mi R-200b-3p的表达;2、采用10m Mβ-GP刺激HASMC诱导钙化,构建pc DNA3.1-SNHG29质粒及SNHG29空载质粒,q RT-PCR检测HASMC中SNHG29m RNA的表达;实验分为四组:NP组、HP组、HP+pc DNA3.1组、HP+pc DNA3.1-SNHG29组;采用茜素红染色观察各组HASMC钙化的情况,并检测各组HASMC的细胞内钙含量及细胞中ALP的活性;Western blot检测各组HASMC中RUNX2、BMP2、α-SMA蛋白的表达。3、使用生物学信息软件Starbase进行预测mi R-200b-3p是否为SNHG29的潜在靶标,双荧光素酶报告基因检测SNHG29与mi R-200b-3p的靶标关系。实验分四组:NP组、HP组、HP+inhibitor组、HP+mi R-200b-3p inhibitor组。采用茜素红染色观察各组HASMC钙化的情况,并检测各组HASMC的细胞内钙含量及ALP的活性;Western blot检测各组HASMC中RUNX2、BMP2、α-SMA蛋白的表达。4、使用生物学信息软件Starbase进行预测α-Klotho是否为mi R-200b-3p的潜在靶标。双荧光素酶报告基因检测α-Klotho与mi R-200b-3p的靶标关系。实验分四组:mimics NC组、mi R-200b-3p mimics组、inhibitor NC组、NP组、mi R-200b-3p inhibitor组。q RT-PCR检测各组α-Klotho、FGFR1、FGF23 m RNA的表达,Western blot检测各组α-Klotho、FGFR1、FGF23蛋白的表达。5、为探讨mi R-200b-3p的过表达和α-Klotho的沉默表达对SNHG29过表达对β-GP诱导HASMC钙化的抑制作用的影响及SNHG29下调mi R-200b-3p对α-Klotho/FGF23轴的影响。本部分实验分为6组:HP+pc DNA3.1组、HP+pc DNA3.1-SNHG29组、HP+pc DNA3.1-SNHG29+mimics NC组、HP+pc DNA3.1-SNHG29+mi R-200b-3p mimics组、HP+pc DNA3.1-SNHG29+sh-NC组、HP+pc DNA3.1-SNHG29+sh-α-klotho组。采用茜素红染色观察各组HASMC钙化的情况,并检测各组HASMC的细胞内钙含量及细胞中ALP的活性;q RT-PCR检测各组α-Klotho、FGFR1、FGF23 m RNA的表达,Western blot检测各组HASMC中RUNX2、BMP2、α-SMA、α-Klotho、FGFR1、FGF23蛋白的表达。结果:1、体外β-GP诱导HASMC钙化过程中,随着暴露钙化时间的延长,细胞活性逐渐下降,钙含量逐渐增加,RUNX2、BMP2表达上调,α-SMA表达下调,HASMC向成骨细胞转化。考虑细胞活性及细胞钙化的需求,因此我们以β-GP处理HASMC 12d作为后续实验的时间点。SNHG29、mi R-200b-3p表达呈现相反的趋势,随着HASMC暴露于β-GP环境下的时间延长,mi R-200b-3p的表达逐渐增强。2、体外β-GP诱导HASMC钙化过程中,过表达SNHG29使HASMC钙化减轻,细胞内钙含量下降,ALP的活性下降,RUNX2、BMP2蛋白的表达下调,α-SMA蛋白的表达上调,提示过表达SNHG29可部分逆转β-GP诱导的HASMC钙化。3、生物学信息软件Starbase预测发现SNHG29与mi R-200b-3p具有可结合性,荧光素酶活性分析示mi R-200b-3p的过表达显著降低SNHG29-WT中的荧光素酶信号。SNHG29的表达水平与mi R-200b-3p有直接相关性,呈现明显的负相关。沉默mi R-200b-3p的表达可使β-GP诱导的HASMC钙化减轻,细胞内钙的沉积减少,ALP活性下降,RUNX2、BMP2 m RNA的表达下调,α-SMA蛋白的表达上调。4、生物学信息软件Starbase预测发现α-Klotho与mi R-200b-3p具有可结合性,荧光素酶活性分析示mi R-200b-3p的过表达显著降低α-Klotho WT中的荧光素酶信号。α-Klotho的表达水平与mi R-200b-3p有直接相关性,呈现明显的负相关。过表达mi R-200b-3p,q RT-PCR结果示HASMC表达α-Klotho、FGFR1、FGF23m RNA下调,Western blot结果示HASMC表达α-Klotho、FGFR1、FGF23蛋白下调;抑制mi R-200b-3p的表达,q RT-PCR结果示HASMC表达α-Klotho、FGFR1、FGF23m RNA上调,Western blot结果示HASMC表达α-Klotho、FGFR1、FGF23蛋白上调。5、q RT-PCR方法检测验证Sh-α-Klotho的转染效率显示沉默α-Klotho基因,α-Klothom RNA的表达明显下降;SNHG29的过表达显著抑制β-GP诱导的HASMC钙化结节形成,细胞内钙的沉积和ALP活性,但mi R-200b-3p的上调和α-Klotho的下调都可以逆转这种效应,同时也可以逆转钙化模型中过度表达的SNHG29诱导的RUNX2,BMP2的抑制和α-SMA的激活;检测各实验组中涉及的关键调控因子的表达发现升高的SNHG29可促进β-GP诱导的HASMC钙化中α-Klotho、FGFR1和FGF23的表达。然而,当用mi R-200b-3p-mimics或sh-α-Klotho转染时,趋势可被扭转。结论:Lnc RNA-SNHG29可通过下调mi R-200b-3p激活Klotho/FGF23轴抑制β-GP诱导的HASMC的钙化,Lnc RNA-SNHG29可作为VC的治疗的新靶点。