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低聚果糖特别是新低聚果糖(neo-FOS)是具有益生元功效的保健型低聚糖类,而产生neo-FOS的β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase,β-Ffase)是其大规模生产瓶颈所在。为了提高β-Ffase产量,本研究应用强启动子构建、转录因子过表达和分泌途径改造等策略以促进毕赤酵母(Pichia pastoris)高效分泌β-Ffase。首先,通过截短毕赤酵母3-磷酸甘油酸激酶启动子(PPGK1)序列和增加转录因子(AFT1)结合位点构建了系列组成型强启动子:PPE、PPD、PPD1、PPD2、PPD5,并利用报告基因egfp对这些启动子进行强度表征。利用这些强启动子调控来源于草酸青霉的β-Ffase基因(PoFF32A)分泌表达,构建系列毕赤酵母重组菌G/PE-BF、G/PD-BF、G/PD1-BF、G/PD2-BF、G/PD5-BF,其胞外β-Ffase酶活较对照菌(G/PGK1-BF)分别提高了 29.9%、32.0%、43.3%、45.4%、57.7%,但均约有20%的β-Ffase酶活残余胞内。其次,重组菌过表达转录因子AFT1后,G/AFT1-PE-BF、G/AFT1-PD5-BF胞外酶活分别提高了 135.5%、98.5%。最后,为了进一步提高G/PE-BF的β-Ffase产量,对分泌途径的HAC1、PDI1、SEC4、SED5基因分别进行过表达,重组菌胞外酶活分别提高了 113.4%、121.1%、16.7%、15.7%。构建的重组菌G/PDI1-PE-BF,摇瓶发酵60h,胞外酶活最高可到27.0U/mL,较对照G/PGK1-BF的提高了 187.2%。因此,本研究为FOS的商业化生产奠定了一定基础,也为提高毕赤酵母的β-Ffase分泌表达提供基因工程改造思路。