生物酶法制备L-核糖

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L-核糖是一种重要的医药中间体,具有重要的医学价值,由L-核糖合成的各种L-核糖衍生物,广泛应用于抗肿瘤和抗病毒领域。L-核糖在自然界中不存在,属于极其稀有的单糖,需由其他物质合成或转化得到。其制备方法从早期的化学合成法逐渐过渡到近几年新兴的生物转化法,国外目前在L-核糖制备方面的研究趋势是通过不同菌种来源寻找活性更高的异构酶。而国内在稀有糖这方面的研究很少,但是对L-核糖的需求量却较大,因此加强对L-核糖制备方面的基础探索是目前稀有糖制备领域研究的重点之一。本研究以L-核糖制备的基础研究为重点,由实验室保存的发酵乳杆菌(简称:L.F)和枯草芽孢杆菌(简称:B.S)为出发菌株,通过驯化后筛选能产L-阿拉伯糖异构酶(简称:L-AI)的L.F和能产6-磷酸甘露糖异构酶(简称:MPI)的B.S,并分别对两种菌的发酵条件和培养基进行了初步优化。对发酵得到的L.F和B.S菌液通过超声破碎法提取,获取L-AI和MPI粗酶液,并进行初步的纯化。确定酶活力测定条件后对L-AI和MPI进行了初步的酶学性质研究,最后将两种异构酶应用到L-核糖的制备过程,并研究了转化反应的各种影响因素。研究结果显示,筛选得到的L.F和B.S菌种能分别产L-AI和MPI。L.F(B.S)的合适发酵条件为培养温度37℃(30℃),初始pH7.5(pH7.2),接种量3%,发酵液总蛋白含量分别为0.052mg/mL(4U/mL)和0.068mg/mL(4.5U/mL)。超声破碎提取L-AI(MPI)条件为作用时间10min,功率0.2kW,硫酸铵沉淀收集30%60%(40%70%)的组分即初步纯化的L-AI(MPI)。酶学性质结果表明,L-AI(MPI)的最适反应温度和pH分别为50℃(40℃)和7.5(7.2);Mn2+和Co2+均提高了L-AI和MPI酶活力,对L-AI(MPI)作用最显著的是分别0.5mM Mn2+和0.5mMCo2+,Cu2+和Hg2+离子则抑制了L-AI和MPI的酶活力。LFAI(BS-MPI)分别对L-阿拉伯糖(L-核酮糖)表现出最高的底物特异性;L-A(IMPI)的t1/2分别为176min(40℃)和196min(30℃)。在制备L-核糖过程时,加入L-AI和MPI共同转化并调节反应条件,6h后总转化率能达到22.75%。
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