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菌寄生是菌寄生真菌与寄主真菌间的一种寄生方式,是自然界普遍存在的一种真菌与真菌之间的相互作用。轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioide)是一种重要的植物病原真菌和菌寄生中的寄主真菌,菌寄生真菌纤细齿梗孢(Olpitrichum tenellum)是轮枝镰孢菌上一种菌寄生真菌,能够与轮枝镰孢菌相互识别,互作并寄生。有证据显示,在菌寄生真菌与寄主真菌相互识别过程中,寄主真菌孢子表面蛋白具重要作用,对其进行研究具有重要科学意义。疏水蛋白(hydrophpbin)是真菌孢子的一种表面蛋白,它由丝状真菌特异产生的一类分泌型小分子蛋白质,存在于真菌菌丝细胞壁、孢子表面等结构。它含有8个半胱氨酸残基和一段分辨性的信号肽,能够自组装成双亲性界面,在真菌生长发育过程中起着极为重要生物学作用。本文首先采用不同的方法(TCA法、SDS煮沸法、蔗糖渗涨法和冻融法)提取轮枝镰孢菌孢子表面蛋白,SDS-PAGE电泳检测结果表明,采用三氟乙酸法获得了约7条蛋白质条带,其中一条12kDa处蛋白含量较高；采用SDS煮沸法获得了约4条蛋白质条带且有约2条带分子量在12kDa处；蔗糖渗涨法和冻融法分别获得约14条和6条蛋白质条带,前者提取出了大于50kDa的蛋白并且比后者多出一条约25kDa的蛋白。这四种方法获取蛋白质条带数量不同,但具有分子量几乎相同的条带。通过比较得知,三氟乙酸法和SDS煮沸法提取的孢子表面蛋白分子量较小,蔗糖渗涨法和冻融法提取的孢子表面蛋白除分子量20kDa以下的蛋白外还能够提取较大分子量的蛋白。为了获得轮枝镰孢菌疏水蛋白基因,根据GenBank中注册的两种疏水蛋白基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增得到HydⅠ和HydⅡ两种疏水蛋白基因cDNA,其中HydⅠ和HydⅡ cDNA全长分别为381bp和372bp,分别包含一个由127和124个氨基酸组成的开放阅读框。构建了毕赤酵母重组表达载体pPIC9K/HydI和pPIC9K/HydII,将重组表达质粒pPIC9K/HydI和pPIC9K/HydII转化毕赤酵母GS115,获得了转酵母工程菌株G-HydⅠ和G-HydⅡ并诱导表达和纯化。纯化HydⅠ蛋白得到一条分子量为11.7kDa的条带,其理论等电点为6.08,纯化HydⅡ蛋白得到一条分子量为11.2kDa的条带,其理论等电点为7.61。纯化后的蛋白与轮枝镰孢菌和纤细齿梗孢孢子进行互作,发现这两种蛋白能够使孢子凝集,HydⅠ使孢子凝集的最适宜pH值为6.0,孢子凝集最多的时间为15min; HydⅡ使孢子凝集的最适宜pH值为7.0,孢子凝集最多的时间为10min。在研究了疏水蛋白孢子对轮枝镰孢菌孢子及纤细齿梗孢孢子的凝聚作用之后,选取了绿色木霉(Trichoderma viride)、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)及九州镰孢菌(Fusarium kyushuense)真菌孢子作为研究对象,进行孢子凝聚实验。结果显示疏绵状嗜热丝孢菌及九州镰孢菌孢子与疏水蛋白互作后孢子凝集,而使凝聚的绿色木霉孢子分散。为了从轮枝镰孢菌基因组中敲除HydⅡ基因,利用同源重组原理,在质粒pUCATPH和pROKII基础上构建了HydⅡ基因的敲除载体pUCATPH-S-PtrpC-hph-TtrpC-X,将带有真菌启动子的潮霉素B抗性基因表达盒PtrpC-hph-TtrpC导入转化载体pROKⅡ中,构建了适合真菌转化的载体pROKⅡ-S-PtrpC-hph-TtrpC-X。