目的肺癌是常见的恶性肿瘤,目前国内外肺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。尽管已经联合应用手术、化疗、放疗和生物治疗等各种手段,但其预后并无明显改善,深入研究肺癌分子生物学特征对肺癌的早期诊断、治疗及改善预后具有重要意义。金属硫蛋白(metallothionein, MT)参与许多病理过程,包括金属离子稳态和解毒、保护氧化损伤、细胞增殖和凋亡、药物和放射治疗耐受和致癌的某些过程。在人体多种肿瘤,如乳腺癌、肾癌、鼻咽癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌及膀胱癌等表达增加,但在某些肿瘤,如肝细胞癌(HCC),前列腺癌和大肠癌表达下调,结论不尽一致。MT在肺癌组织中的表达目前研究报道较少。我们应用免疫组化方法来检测MT在肺鳞癌、腺癌的表达,并探讨其与肺癌临床病理因素间关系。材料与方法1、标本来源(1)石蜡切片收集中国医科大学第一附属医院病理科1999年1月至2009年3月手术切除的标本,包括66例原发灶及相应正常肺组织标本,其中42例有配对的淋巴结转移癌。所有病例术前均未行放疗、化疗,并且临床资料完整。标本均经10%福尔马林固定。常规处理后石蜡包埋。按国际抗癌联盟(UICC)1999年修订的肺癌pTNM分期标准分为：1-2期26例,3-4期40例。年龄在34岁-82岁之间,男性37例,女性29例,中位年龄58岁,平均年龄55岁。肺鳞癌24例(高中分化鳞癌20例,低分化鳞癌4例),肺腺癌42例(高中分化腺癌38例,低分化腺癌4例)。癌旁正常肺组织取自同一患者距肿块边缘5cm以上的正常肺组织,共15例。(2)肺癌细胞系二种分别为：肺腺癌细胞系A549、肺巨细胞癌细胞系BE1。2、试剂实验试剂兔抗人MT单克隆抗体(FL-61,sc-11377)购自三塔公司,s-p试剂盒(kit-9701)购自福州迈新生物技术开发有限公司。3、实验方法(1)细胞培养肺腺癌细胞系A549用DAAM培养基培养、BE1细胞系用含10%的胎牛血清的1640培养基培养后,于含0.5%Co2的37℃孵箱内培养,0.25%胰蛋白酶消化、传代。(2)免疫组织化学(s-p)法操作主要步骤：切片常规脱蜡、水化,3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶,高温高压热修复,柠檬酸盐抗原修复液修复2min,蒸馏水冲洗5＇×3遍、PBS冲洗5＇×3遍,非免疫动物血清室温孵育10min,以封闭非特异性位点。倾去血清加一抗(1：100),4℃于冰箱孵育过夜,蒸馏水冲洗、PBS冲洗5’×3遍,加生物素标记的二抗,室温孵育20min,PBS冲洗5＇×3遍,加即用型广谱试剂盒C液,室温孵育20min。蒸馏水冲洗、PBS冲洗5’×3遍,加即用型广谱试剂盒D液,室温25min。蒸馏水冲洗、PBS冲洗5＇×3遍,DAB显色。苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。结果评定标准以肺癌细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性表达,评分参考文献,结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱两个方面评分结果评定标准。MT阳性表达根据阳性细胞百分率和染色程度进行半定量结果判定：无阳性细胞记0分,阳性细胞百分率≤50%记1分,51%一75%记2分,≥75%记3分；胞浆和／或胞核基本不着色记0分,染色棕黄记1分,染色棕色记2分,染色褐色记3分。每张切片的阳性细胞百分率得分和染色程度得分两项相加作为最后得分。总分为0-1分记为阴性(一),2-3分记为弱阳性(+),4-5分记为阳性(++),6分以上记为强阳性(+++)；以阴性至弱阳性为低表达,阳性至强阳性为高表达。(3)肺癌细胞系的免疫化学染色(s-p)法：选择生长状态好的细胞一瓶,待细胞贴壁生长且伸开伪足,形态恢复正常时倒掉培养基,制作细胞爬片。PBS洗5＇×3遍后,加入固定液固定20分钟。PBS洗5’×3遍后,加入0.2%的Triton-100打孔,370C孵育15分,PBS洗5＇×3遍后加入A液,室温孵育20分,PBS洗5’×3遍后加入B液,室温孵育20分,倾去血清不必冲洗,加稀释的一抗(1：100),4℃冰箱过夜,PBS洗5’×3遍后加入C液,室温孵育15分,PBS洗5＇×3遍。加入D液,室温孵育15分,PBS洗5＇×3遍。DAB显色(棕褐色反应产物代表抗原定位),苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。结果1、MT在肺癌、癌旁正常组织的表达用s-p法进行免疫组织化学染色检测66例鳞癌、腺癌MT的表达。可见肺癌旁正常组织仅见支气管上皮细胞腔膜面MT表达(2/15,13%),肺泡上皮细胞阴性表达；MT在肺癌胞浆中54例阳性表达(54/66,81.81%),出现浅黄色至棕褐色颗粒样物,其中鳞癌21例表达(见图A) (21/24,87.5%)。腺癌33例表达(见图B),(33/42,78.57%)。2、金属硫蛋白基因表达与临床病理参数的关系(见表1)对66例人肺鳞癌、腺癌组织中MT的表达情况行X2检验。结果显示MT表达与年龄(p=0.479)、性别(p=0.079)、组织学分化(p=1.002)、组织学类型(p=0.366)无关,与分期有关(p=0.028),3、4期肺癌组织的阳性表达率显著高于1、2期肺癌组织的阳性表达率。MT在肺癌组织的阳性表达率显著高于肺癌旁组织的阳性表达率P=0.0013、MT在肺癌中的表达与淋巴结转移的关系(表2)在42例配对淋巴结转移组中,原发癌MT的阳性表达率为75.7%(28/37),转移灶MT的表达率为100%(5/5),MT的表达与淋巴结转移有相关性(p=0.002),原发灶与转移灶相比较,MT在肺癌中的阳性强度没有明显改变。4、MT在肺癌细胞系A549、BE1的表达采用s-p法进行免疫组织化学染色检测MT在肺癌细胞系A549、BE1表达,均为胞浆表达。结论MT在肺鳞癌、腺癌中高表达,并与肺鳞癌、腺癌的TNM分期、淋巴结转移有关。