近年来,随着β-内酰胺抗生素的广泛使用,细菌的耐药性问题日益严峻。细菌生产金属β-内酰胺酶(MβL)是临床上最主要的一种耐药性机制,因此围绕MβL展开研究,是细菌耐药性难题得以解决的关键。要实现这一目标,首先必须深入理解“MβL和β-内酰胺类抗生素在原子水平上如何相互作用”这一基本问题。但MβL-抗生素复合物的晶体结构不能稳定存在,使得这一问题难以通过实验来解答。在本研究中,我们以三种代表性的MβL(Bc II、CphA和FEZ)以及四种典型的β-内酰胺抗生素(PV、CFX、IMP和Azt)为研究对象,利用光谱学、分子对接以及分子动力学模拟技术深入探讨了它们之间的分子识别和相互作用机制,以期为上述问题给出一个答案,也为抗MβL水解的新型抗生素的研发提供一些参考和启发。全文主要内容如下:1.通过外源表达含pET28b-CphA和pET28b-FEZ的大肠杆菌BL21(DE3)以及购买获得的Bc II,最终得到了三种代表性MβL。在低温及底物过量的条件下,利用光谱学技术分析了MβL与双环β-内酰胺抗生素(PV、CFX和IMP)结合时的构象变化效应。结果表明,抗生素的结合能引起MβL构象发生改变,即抗生素与MβL在结合时存在一个诱导契合的过程。诱导契合效应强弱依次为:Bc II>FEZ>CphA。2.利用分子动力学技术进一步分析了MβL与双环β-内酰胺抗生素(PV、CFX和IMP)及其水解产物之间的分子识别和相互作用机制。结果表明:与单锌CphA不同,双锌MβL(Bc II和FEZ)与抗生素及其水解产物有相似的结合模式;其结合驱动力主要来自双环β-内酰胺母核上的羧基与MβL结合口袋锌离子之间的静电作用;Bc II和FEZ有柔性的结合口袋,特别是Bc II,使得双环β-内酰胺抗生素和MβL之间能通过诱导契合机制相互适应。这个相互适应是MβL受底物诱导通过改变其结合口袋附近loop构象从而与不同类型双环β-内酰胺抗生素实现完美匹配的一个过程。而CphA的结合口袋柔性小,因此其诱导契合效应比较弱。3.利用光谱学及分子对接技术分析了MβL与单环β-内酰胺抗生素Azt之间的相互作用机制。结果表明,Azt与三种MβL之间的结合作用均较弱,主要原因是Azt中大体积的磺酸基极大削弱了其与MβL结合口袋中锌离子之间的静电作用,提示单环β-内酰胺母核可作为一种对抗MβL水解的新型抗生素骨架分子。4.以含pET28b-CphA的大肠杆菌BL21(DE3)为实验对象,考察了该重组菌在含有连续浓度梯度的比阿培南(BIA)培养基中的进化和迁移。结果表明,在接触致死剂量BIA时,CphA重组菌会快速进入休眠期以免受抗生素攻击,细菌随后开始累积抗药性变异使其能继续向高浓度的BIA区生长迁移。最终在BIA的选择压力下,CphA酶通过变异进化成一个更高效的酶。同样的实验方案也被用于测试CphA重组菌在Azt培养基中的变异和进化情况,但未观察到该重组菌在Azt培养基中的生长和迁移。5.成功建立了MβL色谱模型,并探讨了其在中药活性成分筛选方面应用的可能性。总之,MβL对双环β-内酰胺类抗生素的识别主要通过其分子中的双环β-内酰胺母核来实现,其结合驱动力主要来自双环β-内酰胺母核上的羧基与MβL结合口袋中锌离子之间的静电作用。在不改变母核结构的前提下,对双环β-内酰胺抗生素的进一步改造可能意义不大。因为无论对其侧链基团做何种修饰,都可能被MβL通过其柔性的结合口袋识别(诱导契合效应),进而和MβL完美结合并最终被水解。另外,MβL能够通过变异成为一个更高效的酶,也会对新改进的双环β-内酰胺抗生素构成威胁。而单环β-内酰胺抗生素不存在上述缺陷。因此,基于单环β-内酰胺母核这一理想骨架我们有可能开发出抗MβL水解的新型β-内酰胺药物。