疼痛尤其是病理痛包括慢性疼痛和痛觉敏感是严重的公共健康问题,疼痛的产生是由于各种类型的组织损伤,包括物理创伤、炎症和自身免疫疾病等,常表现为包括损伤部位在内的广泛区域的疼痛、感觉异常和痛觉敏感(包括热痛觉敏感和机械性痛觉敏感)。慢性疼痛在不存在明确伤害性刺激的情况下可能也会持续数月,严重影响个人生活质量。经典的观点认为,疼痛信号首先被外周的感觉器感受并传递至脊髓后角感觉神经元,通过不同的途径,最后传递到相应的感觉皮层。研究发现痛觉传导系统神经元的功能改变与疼痛的异常改变如慢性疼痛等密切相关,其机制包括神经元的异位放电、神经化学物质包括神经递质、炎性介质及细胞因子的过量释放和突触的长时程增强等。有研究表明慢性疼痛可能是周围致敏(初级传入神经元的敏感性增加)和中枢致敏(中枢神经系统的感觉神经元的过度兴奋)等因素共同作用的结果。然而,以往大量的研究主要是基于对神经元的研究,如神经元可塑性、神经递质和神经通路等。虽然长期的研究已积累了大量的资料,但疼痛机制仍未明了,而且依据神经元痛觉学说设计的镇痛措施并不理想。从上世纪九十年代早期,研究者开始关注神经系统的另一种细胞即神经胶质细胞,并且发现胶质细胞在慢性疼痛的病理过程中也发挥着至关重要的作用。虽然神经胶质细胞的数量比神经元的数量多得多,但在神经科学研究的漫长历程中,胶质细胞一直被认为在神经系统只发挥辅助作用,在神经功能活动中如信息的感受、传输、处理过程不发挥作用。如星形胶质细胞被认为仅仅具有支持、保护和营养神经元的作用。而近期的研究证实,神经胶质细胞通过与神经元相互作用参与各种神经功能活动的调控。在各种疼痛模型中包括外周或中枢的神经损伤或炎性痛,动物除表现慢性疼痛的症状(如热痛觉敏感和机械性触诱发痛)外,还出现了脊髓胶质细胞的活化。在神经组织损伤或发生炎症后,星形胶质细胞可以从静息态转化为激活态,活化的星形胶质细胞除表现出形态改变外,还合成和释放大量神经活性物质,包括神经递质(兴奋性氨基酸、ATP、NO等)和细胞因子(NO、IL-1β、IL-6和TNF-α)等,由此参与痛信号的传递与调制。虽然二十年的研究明确证实了胶质细胞在疼痛信号传递、感受、调制的重要作用,但由于神经系统是神经元与胶质细胞形成一个混合的网络体系,因此现有的各实验体系无法对胶质细胞在疼痛产生过程激活和作用机制进行详尽研究,如各种刺激如何激活胶质细胞包括星形胶质细胞和小胶质细胞,何种刺激通过哪种受体,作用如何;胶质细胞如何与神经元相互作用参与疼痛信号处理,如通过产生何种物质(如细胞因子或神经递质)如何作用于神经元以及作用强度、过程均无确切机制。事实上神经胶质细胞与神经元的相互作用由于上述原因(神经元与胶质细胞组成一个混合的网络体系)一直未有明确的结论,影响了对胶质细胞在各种功能活动调控(包括参与疼痛信号的感受、传递、整合)中的作用的深入理解。谷氨酸作为中枢神经系统最重要的兴奋性神经递质,通过不同种类的受体(包括离子型和代谢型受体）在神经生理及病理过程发挥重要作用。虽然已经有证据显示，谷氨酸通过不同的受体在外周及脊髓痛信号感受、传递、调制过程发挥重要作用，但这种作用是基于对神经元、胶质组成的混合网络体系的作用观察，而它对胶质细胞的作用如对星形胶质细胞的作用，如是否会直接刺激活化星形胶质细胞，是否会通过刺激星形胶质细胞释放炎性因子（白介素等）参与疼痛信号处理等尚无报道。目的：1.通过离体培养脊髓星形胶质细胞观察谷氨酸对星形胶质细胞的活化作用，包括形态学观察及IL-6的检测；2.利用痛行为检测方法观察经谷氨酸刺激活化的脊髓星形胶质细胞对动物痛行为的影响。方法：1．原代培养雄性Wistar大鼠（出生后1-2天）的脊髓星形胶质细胞。细胞培养9-14天后，将细胞分为14组：(1)空白对照组，细胞孵育全培液；(2)ATP组（阳性对照），全培液+50μM ATP孵育1小时；(3)全培液+谷氨酸500μM 1 h、6 h、12 h和24 h组；(4)全培液+谷氨酸1000μM 1 h、6 h、12 h和24 h组；(5)全培液+谷氨酸2000μM 1 h、6 h、12 h和24 h组。2．用免疫细胞化学方法鉴定GFAP阳性的星形胶质细胞，并观察细胞活化后形态的变化。3．用ELISA试剂盒检测大鼠脊髓星形胶质细胞中IL-6蛋白水平（反映星形胶质细胞活化的指标）的表达水平，从而观察谷氨酸活化脊髓星形胶质细胞激活的相应浓度和时间过程。4．用Real-Time PCR法检测大鼠星形胶质细胞中IL-6转录水平的表达水平，从mRNA水平观察谷氨酸活化脊髓星形胶质细胞的情况。5．将在体外被激活的脊髓星形细胞通过鞘内插管注射到成年Wistar雄性大鼠（约200g）的脊髓腰膨大部位，分别在细胞注射前和注射后2 h、4 h和6 h检测大鼠的热痛觉敏感反应（PWL），观察活化的脊髓星形胶质细胞在热痛觉敏感中的作用。结果：1．采用GFAP免疫细胞化学的方法鉴定出培养的细胞是星形胶质细胞。2．以全培液组为空白对照组，ATP组为阳性对照组，谷氨酸500μM 24 h组细胞部分发生形态变化，胞体变圆、突起收缩；而谷氨酸1000μM和2000μM组，细胞形态从6 h即开始改变，逐渐到24 h谷氨酸对细胞的作用强度达到最大（该时间为本实验研究的最后一个时间点）。3．IL-6蛋白检测结果显示，谷氨酸500μM在4个时间点的IL-6水平与空白对照组(10.81±2.87)相比，均无统计学差异。而谷氨酸1000μM和谷氨酸2000μM组，IL-6含量从6小时开始明显增加(分别为153.30±2.08和69.41±18.14)，并随时间逐渐上升。但谷氨酸2000μM组IL-6比1000μM组相比较低。IL-6含量在谷氨酸1000μM 24 h组(426.53±33.89)达到最高(p<0.05)。4．IL-6 mRNA检测结果显示，与空白对照组(1.05±0.17)相比，IL-6转录水平在谷氨酸500μM作用于细胞24 h（17.77±2.32，P<0.05）大大增加；在谷氨酸1000μM和2000μM组作用细胞6 h，IL-6开始转录增加（分别为4.52±0.96和3.47±0.30，P<0.05）；谷氨酸浓度为500μM、1000μM和2000μM作用于细胞24 h（本实验研究的最后一个时间点），IL-6转录水平明显增加(分别为17.77±2.32、22.43±1.42和24.12±3.14，P<0.05)，且呈浓度依赖性上升趋势。5．上述实验结果提示，谷氨酸激活脊髓星形胶质细胞的有效浓度为1000μM和2000μM，有效时间点为6 h、12 h和24 h。6．将谷氨酸刺激活化的星形胶质细胞注射入成年大鼠脊髓蛛网膜下腔内，发现在注射后2小时，大鼠的PWL开始明显降低(P<0.05)，并且在注射后4 h和6 h随时间逐渐降低（P<0.05）。结论：1．谷氨酸可以直接活化脊髓星形胶质细胞，其有效浓度为1000μM，时间需持续6 h以上。2．通过谷氨酸激活的脊髓星形胶质细胞参与了热痛觉敏感的形成。3．谷氨酸激活的星形胶质细胞释放的细胞因子如IL-6可能在热痛觉敏感的形成中发挥重要作用。