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目的:在全世界范围内乳腺癌已经超过肺癌成为女性最高发的恶性肿瘤,是威胁女性生命健康的重要原因之一。乳腺癌干细胞（breast cancer stem cells,BCSCs）在乳腺癌中占比极少但可以使得乳腺恶性肿瘤具有复杂多样的异质性,在乳腺癌的发生发展、侵袭迁移和复发耐药中具有极其重要的地位。探究乳腺癌干细胞相关的生物学特性在研究乳腺癌的发病机制、转移途径和筛选有效的治疗靶点过程中具有深远意义。核仁小RNA（small nucleolar RNAs,sno RNAs）是一类广泛存在于真核生物中的转录本长度60-300个核苷酸的无蛋白编码功能的RNA,具有保守的二级结构,依据其结构和主要功能可以分为C/D box sno RNAs、H/ACA box sno RNAs和sca RNAs。Sno RNAs经典的生物学功能是参与核糖体RNA（ribosomal RNA,r RNA）前体的剪接加工和转录后修饰过程,此外还能够参与RNA可变剪切、RNA翻译调控以及氧化应激等过程,逐渐成为肿瘤学相关研究领域的新热点。Sno RNAs可以在非小细胞肺癌、卵巢癌、头颈部鳞癌和肝癌中通过调控肿瘤细胞的干细胞样特性影响疾病的恶性进程,对肿瘤发生和干细胞特性维持具有重要作用。在乳腺恶性肿瘤的干细胞表型中,目前仅有研究发现sno RNAs可能通过上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）过程影响乳腺癌干细胞样特性,因此进一步探究sno RNAs和乳腺癌干细胞样特性之间的关系或可为乳腺癌的诊疗打开新的思路。核糖体蛋白（ribosomal proteins,RPs）属于核仁蛋白,在真核生物中除了作为翻译机制的组成部分外,还可以发挥多种核糖体外功能来影响疾病的发生。目前已知RPs的生物学功能包括影响核仁结构和参与p53依赖的核仁应激反应以及p53非依赖的核糖体外机制。随着研究的不断深入,sno RNAs和RPs两者之间被发现存在相互作用,sno RNAs能够通过影响RPs进而调控其下游信号通路影响恶性肿瘤的疾病进程,这为探究sno RNAs和RPs在其经典作用途径之外对于恶性肿瘤的调控作用提供了新方向。本研究基于具有乳腺癌干细胞样特性的乳腺球（mammosphere,MS）细胞进行,通过高通量测序筛选与乳腺癌干细胞样特性相关的SNORA51,分析其在乳腺癌中的表达以及与预后和临床病理因素的关系,并在分析其对乳腺癌干细胞样特性的促进与维持作用的基础上进一步通过核仁核质的亚细胞分离实验分析验证SNORA51通过调控RPL3/NPM1/c-MYC途径影响乳腺癌干细胞样特性的分子生物学机制。本研究有望为sno RNAs调控乳腺癌乃至其他恶性肿瘤的干细胞样特性提供新的思路,有望为恶性肿瘤的发生发展和临床诊疗提供新的理论依据和实验基础。研究方法:1、具有乳腺癌干细胞样特性的乳腺球细胞的诱导与鉴定:使用含有生长因子的无血清培养基悬浮培养乳腺癌细胞MCF-7和T47D,6-8天后细胞形态出现明显变化,呈球形快速生长。通过流式细胞术、q RT-PCR、Western Blot、Transwell和乳腺球细胞分化实验验证干性。2、基于高通量测序筛选MCF-7 MS和MCF-7细胞中差异表达的SNORA51并进行生物信息学相关分析:以稳定生长且状态良好的乳腺癌细胞MCF-7和具有干细胞特性的乳腺球细胞MCF-7 MS为样本进行高通量测序,筛选出在MCF-7 MS中较MCF-7明显高表达的SNORA51。基于TCGA数据库分析SNORA51在乳腺癌中与干性指标和预后的关系。3、基于临床组织样本研究核仁小RNA SNORA51在乳腺癌中的表达和临床意义:通过q RT-PCR和原位杂交实验检测30对新鲜乳腺癌组织和158例乳腺癌患者的石蜡切片中SNORA51的表达,通过q RT-PCR和免疫组织化学检测30对新鲜乳腺癌组织和158例乳腺癌患者石蜡切片中干性指标OCT4的表达。采用Spearman相关性分析研究SNORA51与OCT4的表达相关性。采用Kaplan-Meier分析研究SNORA51在乳腺癌患者中与总生存以及无病生存的关系。通过Pearson卡方检验、Fisher精确检验和Logistic回归分析SNORA51与临床病理因素的关系。4、分析SNORA51对乳腺癌干细胞样特性的促进和维持作用:在乳腺癌细胞MCF-7和T47D中构建SNORA51高表达细胞模型,流式细胞术、q RT-PCR、Western Blot检测SNORA51对干性指标表达的影响,CCK-8、平板克隆、Transwell、划痕实验检测SNORA51对乳腺癌干细胞样特性的影响。在乳腺球细胞中转染SNORA51的反义寡核苷酸构建SNORA51低表达的细胞模型,流式细胞术、q RT-PCR、Western Blot检测干性指标的表达变化,CCK-8、Transwell和乳腺球形成实验检测SNORA51对乳腺癌干细胞样特性的影响。5、SNORA51调控乳腺癌干细胞样特性的分子机制研究:基于生物信息学筛选与SNORA51表达显著负相关的核糖体蛋白RPL3,通过亚细胞结构分离实验和Western Blot检测SNORA51的表达变化对核仁RPL3表达的影响以及对NPM1在核仁核质中表达的影响。Co-IP实验检测SNORA51表达水平的变化对细胞核中RPL3-NPM1以及NPM1-c-MYC的结合作用的影响,联合NPM1在核仁核质中表达的变化以及核质中c-MYC表达量的检测验证SNORA51通过RPL3/NPM1/c-MYC途径调控乳腺癌干细胞样特性的分子机制。6、动物实验:通过构建裸鼠移植瘤模型在体内验证SNORA51通过RPL3/NPM1/c-MYC途径调控乳腺癌干细胞样特性的机制。结果:1、具有乳腺癌干细胞样特性的乳腺球细胞的诱导与鉴定:贴壁的乳腺癌细胞经过无血清悬浮培养后成球形生长,乳腺球细胞中的CD24-/lowCD44+细胞亚群较贴壁生长的乳腺癌细胞明显增多（p＜0.0001）,干性指标SOX2、OCT4和Nanog在乳腺球细胞中明显上升（p＜0.05）,乳腺球细胞具有更强的迁移能力（p＜0.001）并具有分化潜能。2、高通量测序结果表明SNORA51在乳腺球细胞中相较于乳腺癌亲本细胞明显高表达。基于TCGA的数据分析发现SNORA51在乳腺癌中的表达与干性指标OCT4、SOX2、MYC和HIF-1α的表达呈正相关（p＜0.05）,且SNORA51的高表达与乳腺癌的不良预后显著相关（p=0.0034）。3、SNORA51在乳腺癌组织中的表达和临床意义:SNORA51在30对新鲜乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织（p＜0.0001）且其表达与干性指标OCT4的表达呈正相关（p=0.0003,r=0.6135）。在158例乳腺癌患者中,SNORA51高表达的患者94例（59.49%）,SNORA51低表达的患者64例（40.51%）,SNORA51和干性指标OCT4的表达呈现正相关（p＜0.0001,r=0.411）。Kaplan-Meier分析发现158例乳腺癌患者中SNORA51高表达的患者总生存期（p=0.0021）和无病生存期（p=0.0168）较短。在与临床病理因素的相关性分析中,SNORA51与淋巴结状态（p=0.002）、ER表达水平（p=0.024）、Ki-67表达水平（p=0.033）、组织学分级（p=0.002）和TNM分期（p=0.043）显著相关。多因素Logistic回归分析发现,淋巴结状态（p=0.021）、Ki-67表达水平（p=0.023）和组织学分级（p=0.021）是SNORA51表达的独立影响因素。4、分析SNORA51对乳腺癌干细胞样特性的促进和维持作用:SNORA51高表达的乳腺癌细胞MCF-7和T47D中CD24-/lowCD44+细胞亚群比例明显增多（p＜0.0001）,干性指标SOX2、OCT4和Nanog的表达明显上升（p＜0.05）。SNORA51高表达的乳腺癌细胞增殖能力和克隆形成能力明显增强（p＜0.01）,细胞的迁移能力明显增强（p＜0.05）。在SNORA51低表达的乳腺球细胞MCF-7MS和T47D MS中CD24-/lowCD44+细胞亚群比例明显降低（p＜0.0001）,干性指标SOX2、OCT4和Nanog的表达明显下降（p＜0.05）。SNORA51低表达的乳腺球细胞增殖能力和乳腺球形成能力明显降低（p＜0.01）,细胞的迁移能力也明显降低（p＜0.001）。5、SNORA51能够通过RPL3/NPM1/c-MYC途径调控乳腺癌干细胞样特性:基于生物信息学筛选与SNORA51的表达显著负相关的核糖体蛋白RPL3（p=0.0021）。亚细胞分离实验和Western Blot实验验证SNORA51高表达的乳腺癌细胞MCF-7和T47D中RPL3在核仁的表达明显降低（p＜0.05）,NPM1在核仁中表达降低的同时在核质中表达明显上升（p＜0.05）。Co-IP结果表明细胞中SNORA51的高表达能够在降低细胞核内RPL3与NPM1结合的同时升高NPM1与c-MYC的结合并增强核质中c-MYC的表达（p＜0.05）。在双向干预SNORA51和RPL3后,SNORA51高表达引起的干性指标表达增高和增殖迁移能力增强可以被RPL3的高表达逆转。6、动物实验验证SNORA51通过RPL3/NPM1/c-MYC途径调控乳腺癌干细胞样特性的机制:在裸鼠移植瘤模型中,SNORA51的高表达可以促进肿瘤的生长,其促进作用可以被RPL3表达水平的上升而逆转。在SNORA51高表达的移植瘤中,干性指标OCT4和增殖指标Ki-67的表达明显上升,其上升趋势同样可以被RPL3的高表达逆转。剖取移植瘤后提取总蛋白检测干性指标SOX2、OCT4、Nanog的表达以及通过亚细胞结构分离实验检测核仁中RPL3、NPM1和核质中NPM1、c-MYC的表达得到了与体外细胞实验相一致的结果,在体内水平验证了SNORA51通过RPL3/NPM1/c-MYC途径调控乳腺癌干细胞样特性的机制。结论:1、SNORA51与乳腺癌干细胞样特性相关,其在乳腺癌组织中显著高表达且与不良预后相关;2、SNORA51具有促进和维持乳腺癌干细胞样特性的生物学功能;3、SNORA51的高表达能够降低细胞核仁内RPL3的表达,同时触发NPM1在核仁核质中的表达变化并增强核质中c-MYC的表达,SNORA51能够通过RPL3/NPM1/c-MYC途径促进乳腺癌干细胞样特性。