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目的：本研究利用复制缺陷的5型腺病毒做载体与外原性野生型p53cDNA重组而成的腺病毒-p53复合体，将外源性野生型p53基因导入结直肠癌细胞核，观察外源性野生型p53基因对结直肠癌细胞的抑制作用，比较p53基因状态不同的结直肠癌细胞对p53基因治疗敏感性是否存在差异，进而深入探讨p53基因抑制肿瘤细胞增殖的机制。方法：本研究分为三个部分：第一部分着力于选择p53基因状态不同的结直肠癌细胞株，分别通过H．E．染色光镜下观察细胞形态、免疫细胞化学染色方法检测内源性p53蛋白表达和PCR-SSCP银染方法检测内源性p53基因5-8外显子状态，最终筛选出内源性p53基因缺失、突变和正常的三种细胞株，为后续研究工作打下基础。第二部分中，首先采用MTT法选择Ad-wtp53的最佳转染滴度，分别应用PCR技术检测外源性腺病毒载体DNA片段在细胞核内的存在和免疫细胞化学技术检测p53蛋白表达，以验证Ad-wtp53转染结直肠癌细胞的效果。第三部分 天津医科大学硕士生论文 中文摘要 中，以最佳转染滴度的Ad－tp53感染三种结直肠癌细胞，分别采用相差显微 镜观察活细胞形态、H卫．染色光镜下观察固定细胞形态、以非转染细胞和转 染、AdLacZ细胞做对照绘制生长曲线、以Ad－LacZ细胞做对照观察集落形 成率，最后用碘化丙陡（PI）单染色法，经流式细胞仪检测细胞周期变化。 分析所得结果，探讨外源性野生型p53基因的导入对三种结直肠癌细胞生长 的影响，同时比较分析内源性p53状态的不同与p53基因靶向治疗的关系。 结果：第一部分结果表明①三种结直肠癌细胞均属上皮型细胞，但细胞形态 不同；②三种结直肠癌细胞的p53蛋白表达不同，THCE908细胞呈阴性表 达；HT－29细胞呈阳性表达，表达率32刀％；L。V。细胞呈强阳性表达，且表 达率高乃4刀％）；③三种结直肠癌细胞的 p53基因状态不同，THC七908细 胞存在p53等位基因缺失，LoVO细胞存在野生型p53基因，HT上9细胞存在 突变型p53基因。第二部分结果表明①Adwtp53细胞抑制作用与转染滴度在 一定范围内成正比，转染滴度在 10MOI时三种细胞达到半数抑制，在 1 000MOI时表现出最强的细胞抑制作用，感染强度继续提高到 10 000MOI细 胞抑制作用不再增强：②＊小一…3可以成功转入三种结直肠癌细胞核， THC｛908细胞野生型p53蛋白表达阴性转为阳性。③从细胞形态学改变， 可以提示Ad。tp53的导入具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。④LOVO细胞和 HT《9细胞导入Ad－tp53后，细胞核染色加深，p53蛋白表达量增加，但表 达p53蛋白的阳性细胞数未见明显提高。第三部分结果表明①转染Ad－wtp53 后三种结直肠癌细胞均受到明显抑制，表现为细胞变圆、单个散在、失去细 胞间连接、细胞核染色质颜色加深、核小体分离、核碎裂等一系列凋亡细胞 的特征；②细胞生长抑制实验表明，Ad－Wtp53对三种结直肠癌细胞均有抑制 作用，抑制率均超过65％，其中THC－8908细胞最为敏感，抑制率达到89刀9％。 而Ad．LacZ组对三种细胞均无明显影响；＠集落形成能力实验与细胞生长抑 制实验结果一致，显示Adwtp53对三种结直肠癌细胞的体外增殖能力具存明 显的抑制作用，其中THC－8908细胞也表现得最为敏感，集落形成率为0。 AdLacZ组对三种细胞无明显影响；④细胞周期分析表明，三种细胞转染 2 天津医科大学硕士生论文 中文摘要 Ad－tP53后GdGI期细胞比例增加，表明Ad－p53作用在QS过渡期，使 细胞周期停滞于GJG1期。结论：Ad－tp53基因导入三种结直肠癌细胞，能 够显著抑制它们生长和繁殖，使三种细胞周期停滞于＊GI期；Ad－tp53基 因导入对内源性p53基因缺失细胞的抑制作用高于存在内源性野生型和突变 型p53基因的细胞；外源性Wtp53的导入对内源性Wtp53基因缺失和内源性 Wtp53基因正常的细胞GZ－M期具有相反的调控作用。