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环境有机污染物,特别是持久性有机污染物一般具有很高的稳定性,不易降解,可以通过食物链在生物体中富集,某些特定污染物具有强烈的致癌、致畸特性,因而引起人们的广泛关注。这些有毒化学污染物往往共存于环境中造成复合污染,复合污染物的不同组分以及相关毒性的高通量分析是近年来国际研究的热点。有机污染物的传统分析多采用色谱法,一般需要复杂的前处理,耗时较长,仪器较大,不易实现快速、现场检测,而且难以实现复杂组分的同时检测。因此,开发快速、灵敏、高通量的环境污染物筛查技术对应对环境突发污染事件以及复合污染具有非常重要的意义。
本文利用核酸作为载体可以结合多个荧光信号分子的性质,实现了荧光信号的放大,并将该信号放大体系成功应用于微孔板和蛋白质芯片检测平台,实现了三种环境污染物(雌二醇、多环芳烃、多溴联苯醚)的免疫阵列分析。主要工作如下:⑴合成了半抗原4’-醛基2,4,2’-三溴联苯醚,然后分别利用1-芘丁酸和4’-醛基2,4,2-三溴联苯醚作为前体,合成了针对多环芳烃(PAHs)和多溴联苯醚(PBDEs)的牛血清白蛋白偶联抗原,并进行了相应的化学表征。⑵采用表面等离子体基元共振(SPR)的方法对合成的PBDE抗原的免疫活性进行了表征,结果表明合成抗原能够有效的识别多溴联苯醚的抗体,并且具有一定的选择性。⑶利用核酸/荧光染料结合物的信号放大作用在微孔板上完成了多环芳烃、多溴联苯醚的竞争检测。首先通过链式聚合酶反应(PCR)合成了长度为219bp的双链脱氧核苷酸分子,并用凝胶电泳的方法表征了它的纯度与链长;然后将生物素化的DNA和荧光染料分子(SYBR GreenⅠ)相结合,通过生物素-链霉亲和素这一生物反应将核酸荧光探针标记到抗体上;最后,使用间接荧光免疫竞争法获取了相应污染物的竞争曲线。通过竞争曲线获得污染物的检测限(LOD),其中,苯并[a]芘(B[a]P)和2,2,4,4’-四溴联苯醚(BDE-47)的LOD分别达到了3.98μg/L和0.73μg/L。分别考察了4种PAH类似物和5种PBDE的同系物对B[a]P和BDE-47的交叉反应率,结果和酶联免疫检测(ELISA)的相关报道一致。此外,使用PAH的免疫阵列检测了大连海油泄漏事件中采集的海水样品,有PAHs成分检出。⑷在微孔板实验条件的基础上,进一步开展了核酸/荧光染料结合物的信号放大体系在蛋白质芯片技术平台上的应用。首先,考察了不同化学基团(醛基,环氧基,氨基,琼脂糖)修饰的基片对半抗原的固定效果,并最终确定环氧化基片作为实验基片;在考察了各生物分子在蛋白质芯片实验体系中的使用浓度以及优化控制荧光染料分子在环氧化基片表面非特异性吸附之后,分别完成了雌二醇(E2)、苯并[a]芘(B[a]P)、2,2’,4,4’-四溴联苯醚(BDE-47)的检测,LOD分别为42.7ng/L,12.0μg/L,2.19μg/L,并分别用芯片和色谱的方法对加标水样进行了检测,验证了芯片分析的准确性。在考察了混合抗体溶液对实验体系的影响之后,在芯片表面设计阵列成功实现了三种有机污染物的同时检测,并合成了BSA-Cy3作为内标物,对芯片的质量进行控制评估。⑸基于核酸/荧光染料分子信号放大体系建立起来的蛋白质芯片分析技术,实现了环境有机小分子高通量检测,雌二醇的检测限达到了pg/mL的水平,相比于传统的Cy3或者Cy5标记的蛋白质芯片,检测限降低了两个数量级,该方法不需要复杂的样品前处理,样品消耗量极少,可以有效地降低分析成本。而通过制备具有更好选择性和特异性的抗原抗体,针对B[a]P和BDE-47的免疫阵列的灵敏度还可以进一步提高。蛋白质芯片技术具备灵敏,易于小型化、高通量的特点,在应对环境突发事件以及环境污染物的大规模快速筛查时展现出了巨大的应用潜力。