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目的本研究利用荧光能量共振转移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）技术,建立SARS-CoV-2 3CLpro活性检测方法,进行3CLpro抑制剂的高通量筛选和机制研究。一方面本课题从中药（TCM）单体文库中筛选出有效蛋白酶抑制剂,并对其进行抗SARS-CoV-2活性及细胞毒性评价,鉴定有效抑制SARS-CoV-2感染的化合物。另一方面将SARS-CoV-2 3CLpro作为机制研究平台,揭示抗SARS-CoV-2活性中药单体靶向3CLpro的作用机制。方法1.基于FRET建立SARS-CoV-2 3CLpro筛选体系。通过构建C端带有His标签的3CLpro重组质粒,在体外表达纯化得到目的蛋白。测定200 nM的3CLpro与不同浓度的FRET底物混合时的反应初始速度并绘制V0-[S]关系曲线,通过Michaelis-Menten方程进行曲线拟合,得出米氏常数（Km）值,表征3CLpro酶活特征。计算Z-score评估数据质量,评价高通量筛选的可行性。2.SARS-CoV-2 3CLpro抑制剂高通量筛选。基于FRET筛选体系,优化检测条件,对1920种中药单体化合物进行高通量筛选。在活性较好的中药单体反应体系中加入二硫苏糖醇（Dithiothreitol,DTT）,验证活性单体的抑制作用是否受到影响,防止非特异性硫醇反应化合物共价修饰半胱氨酸。荧光干扰实验排除假阳性结果。结合文献报道,过滤掉已被证明具有抗SARS-CoV-2 3CLpro活性的中药单体,选择新型的抑制作用显著的中药单体,进行SARS-CoV-2活病毒实验,以验证抗病毒效果。3.中药单体抗病毒活性及细胞毒性评价。本研究对高通量筛选得到的3CLpro抑制剂以及具有广谱抗病毒活性的化合物诃子鞣酸（Chebulagic acid,CHLA）、安石榴苷（Punicalagin,PUG）,进行空斑减数实验（Plaque reduction assay）,检测细胞水平上中药单体对SARS-CoV-2活病毒的半数有效浓度EC50（Concentration for 50%of maximal effect,EC50）。测定化合物细胞半数毒性浓度CC50（The half of the cytotoxic concentration,CC50）。4.广谱抗病毒化合物CHLA和PUG靶向3CLpro的作用机制研究。基于CHLA和PUG抗SARS-CoV-2活病毒的抑制作用,利用构建的3CLpro机制研究平台研究CHLA和PUG的作用机制,鉴定两个化合物特异性靶向3CLpro,利用酶动力学实验鉴定抑制类型;免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP）实验分析CHLA和PUG对3CLpro二聚化的影响;热漂移实验（Thermal shift assay,TSA）检测两个化合物对3CLpro热稳定性的影响;MALDI-TOF质谱实验验证蛋白-小分子的相互作用。结果1.SARS-CoV-2 3CLpro筛选体系的可行性评价。首先经Ni-NTA柱层析纯化后,得到高纯度3CLpro蛋白。酶动力学实验测定酶促反应初速度,Michaelis-Menten 方程计算得出 Vmax=26.11±0.35 nM/s,Km=51.61±2.96 μM。计算Z-score为0.75,表明该检测方法具有很高的重复性、稳健性和可靠性,可用于高通量筛选。2.SARS-CoV-2 3CLpro作为筛选平台,从1920种中药单体文库中初次筛选出48个抑制作用较好的中药单体,通过DTT依赖实验,二次筛选出19个中药单体具有显著的抗3CLpro活性。剔除掉已被文献报道的具有抗SARS-CoV-2 3CLpro活性的中药单体,其他化合物种银杏酸（Ginkgolicacid,GA）、漆树酸（Anacardic acid,AA）作为一种SARS-CoV-2 3CLpro不可逆抑制剂（IC50值分别为1.79±0.58和2.07±0.35 μM）,具有体外抗SARS-CoV-2病毒活性。3.中药单体抗SARS-CoV-2活病毒空斑减数实验发现,筛选得到GA和AA两个中药单体在15 μM无毒浓度下抑制了病毒空斑的形成,表明这两种抑制剂能够阻断SARS-CoV-2的复制。此外,广谱抗病毒化合物CHLA和PUG具有更优的抗 SARS-CoV-2 活性,EC50 值分别为 9.76±0.42 μM 和 7.20±1.08μM,CC50值＞100 μM,选择性指数（SI=CC50/EC50）分别大于10和13。4.SARS-CoV-2 3CLpro作为机制研究平台,发现CHLA和PUG显著抑制3CLpro水解活性,IC50分别为 9.09±0.87 μM 和 4.62±0.27 μM,表明 CHLA 和PUG特异性靶向3CLpro抑制SARS-CoV-2的感染,且表现出可逆、非竞争性的抑制模式。CO-IP实验表明CHLA和PUG影响了 3CLpro的二聚化,它可能通过干扰蛋白酶的二聚化来降低酶的蛋白水解活性。TSA实验中PUG的干预导致3CLpro热失稳,随着化合物浓度增加,3CLpro的熔解温度（Tm）递减,呈浓度依赖性变化。MALDI-TOF质谱实验中CHLA共价修饰肽段295DVRQCSGVTF305,表明CHLA可以改变或破坏活性SARS-CoV-2 3CLpro二聚体的周围微环境或关键的相互作用,从而影响蛋白的水解活性。结论本研究建立了基于FRET的SARS-CoV-2 3CLpro活性检测方法,并评价其作为高通量筛选方法的可行性。作为3CLpro抑制剂高通量筛选平台,本研究对1920个中药单体进行筛选,在获得的活性中药单体中,鉴定了两个中药单体GA和AA具有体外抗SARS-CoV-2活性。基于课题组前期发现广谱抗病毒化合物CHLA和PUG具有抗流感活性,本研究首次证明CHLA和PUG能够抑制SARS-CoV-2病毒复制。机制研究发现CHLA和PUG显著抑制3CLpro水解活性,特异性靶向3CLpro抑制病毒复制。CHLA和PUG是一种可逆的、非竞争性3CLpro抑制剂,通过破坏3CLpro二聚体形式,阻断酶的催化活性。MALDI-TOF质谱实验发现CHLA与结构域Ⅲ处肽段295DVVRQCSGVTF305相互结合,可能是潜在的作用位点。