【研究背景】人感染禽流感事件在国内频发。且国内几乎所有的禽流感疫情均和H9N2亚型相关。H9N2禽流感病毒将内部基因捐献给H5N1和H7N9等亚型,帮助其完成从野禽病毒到家禽病毒的过渡,并进一步造成人类感染。同时,H9N2亚型禽流感病毒亦可感染人,但症状轻微。目前全球的确诊病例约70例,多半发生在中国。在本课题,我们报道了一例H9N2感染患者。该患者是一名9岁孩童,病情危重,危及生命,但由于及时救治和正确治疗,患儿转危为安。此病例的病情与过往报道的H9N2感染病例差异极大。我们从临床样本中成功分离了H9N2禽流感病毒。命名为A/Suzhou/GIRD01/2019（H9N2）（SZ/GIRD01）。随后,我们对该毒株进行了风险评估,分析了该毒株对人的致病潜力。对该毒株和以往的H9N2经典毒株以及同时代的禽源H9N2毒株进行了详细对比。【研究目的】本项目通过基因分析,体内、外实验分析等手段,探究人源病毒株SZ/GIRD01对哺乳动物以及人的致病潜力。【研究方法】1.临床分析:1、利用患者的病程记录,结合文献报道的其它H9N2感染者情况,综合分析和对比H9N2感染患者发病特点;2、利用Real Time PCR技术分析检测样本中的病毒核酸,评估患者排毒特点;3、分析患者流行病学史,结合对患者父母的检测结果,综合判断患者可能的感染途径;4、对患者呼吸道样本进行二代测序,分析流感病毒在患者体内的适应性进化。2.临床病毒分离和毒株培养:1、从临床样本分离病毒株;2、通过反向遗传学方法构建作为对照的病毒株;3、在鸡胚或者MDCK细胞中培养病毒;4、浓缩病毒。3.SZ/GIRD01毒株的基因分析:1、对SZ/GIRD01毒株进行测序分析;2、构建系统发育树,分析SZ/GIRD01毒株的基因型,并对毒株进行基因溯源;3、执行多序列比对,识别SZ/GIRD01毒株及其它国内分离的H9N2毒株的基因特点和关键的基因标记物。4.体外实验:1、在MDCK细胞系中检测病毒复制动力学;2、利用ELISA方法检测病毒对不同类型的唾液酸受体类似物的结合情况;3、利用ELLA和MUNANA实验分析检测病毒神经氨酸酶活性;4、利用血凝素和神经氨酸酶工作温度不同,进行病毒洗脱实验观察HA和NA之间的平衡;5、检测不同毒株对神经氨酸酶抑制剂的敏感性。5.小鼠模型:构建BALB/c小鼠感染模型,根据小鼠体重变化情况评估病毒对哺乳动物的致病性。并在小鼠感染后第28天收集血清,利用血凝抑制试验测定血清抗体产生情况。【实验结果】1.患者因发热、呕吐、喘息和呼吸困难入院。入院当天迅速转入ICU病区,采用机械通气供氧。患者被诊断为肺炎和I型呼吸衰竭。在患者的肺泡灌洗液中发现了呼吸道合胞病毒和甲型流感病毒。住院期间,采用抗病毒、抗菌、抗炎及支持治疗,患者成功康复,于入院第13天出院。2.在患者肛拭子、咽拭子和肺泡灌洗液中均检测到了H9N2禽流感病毒,表明下呼吸道和肺外组织受累。3.G57基因型是目前国内H9N2亚型病毒的优势基因型。SZ/GIRD01属于G57基因型。4.国内的H7N9、H9N2和部分H5亚型毒株共享内部基因。SZ/GIRD01毒株PA基因和H7N9的PA基因在基因树上聚集成独立分支。其它7个基因和长江三角洲地区分离的H9N2毒株相似度高;5.G57亚型毒株携带有哺乳动物适应性氨基酸突变,包括HA-Q226L、NA62-64氨基酸删失、PB2-E627V、HA-T190A、PA-K356R等。此外,SZ/GIRD01出具有上述突变外,还携带有HA-N158D、PB2-V598I突变;6.SZ/GIRD01在哺乳动物细胞中展示出比季节性流感毒株（H1N1、H3N2）和先代H9N2毒株（G1系、BJ94系H9N2毒株）更强的复制能力;7.SZ/GIRD01毒株可与ɑ2,3和ɑ2,6唾液酸受体结合,但更倾向于结合α2,6（人类受体）;8.SZ/GIRD01对神经氨酸酶抑制剂敏感;9.SZ/GIRD01可在无前期适应的情况下感染小鼠。被感染小鼠无明显症状,病情较轻。【结论】我们的研究结果发现人源SZ/GIRD01毒株的致病性要弱于禽源ZJ/198毒株。但这两株G57毒株均表现出相同的受体结合倾向性和体外复制能力。尽管SZ/GIRD01对小鼠致病能力不强,但其更倾向结合人类受体以及在体外的高复制能力均表现出该毒株对人的致病潜力。同时,我们的系统发育分析明确了G57基因型毒株在国内的优势地位,也证实了不同亚型病毒之间的广泛重组现象。基因分析结识了G57基因型毒株具有的多种哺乳动物适应性突变。上述结果反应了国内流行的H9N2毒株的潜在威胁性。我们应当加强对H9N2病毒的监控,防患于未然。