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目的临床上,由于外伤、肿瘤、炎症或骨吸收引起大面积的骨缺损无法自行修复和重建,骨移植替代材料常常被用作大型骨缺损的替代体,应用于骨缺损的修复中。理想的骨替代材料需要有良好的生物相容性,对机体无毒性,不引起机体炎症反应,同时要有良好的骨传导性和/或骨诱导性,并且可以在机体内自行降解,最终被宿主新生骨组织所替代。nHAC/PLA支架材料是一种具有与天然骨相似成分及结构的骨支架材料,本研究中将人成骨细胞MG-63与其复合体外培养,以观察其对成骨细胞附着、增殖及生物学功能的影响,为其进一步的临床应用提供依据。在以往骨组织工程的研究工作中,由于组织工程支架材料多具有三维立体结构,不透光,因此研究者很难使用传统的手段直观地观察细胞在材料上的生长状况,给研究细胞在材料上附着生长的规律带来困难。目前尚未有较好的观察复合物中细胞生长的方法。活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetatesuccinimidyl ester,CFDA-SE)是一种活体荧光染料,研究显示,CFDA SE作为细胞标记物,能稳定地存在于细胞核中且不会引起细胞发生凋亡。本研究应用CFDASE标记人成骨细胞,检测对细胞粘附功能的影响,并动态观察人成骨细胞在nano-hydroxyapatite/collagen/Poly L-lactic acid(nHAC/PLA)骨支架材料上的粘附生长状况。此外,骨组织中的血管再生是骨重塑和生长的重要部分。与骨重塑及骨内血管发生密切相关的两种细胞——成骨细胞和血管内皮细胞,以及二者间的相互作用是相关领域研究的热点内容。研究表明,血管内皮细胞合成分泌的血管再生相关因子,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)有诱导血管生成、参与创伤愈合等作用;成骨细胞表面有内皮素-1(endothelin-1,ET-1)受体,它可与血管内皮细胞分泌的ET-1相结合提高成骨细胞的功能。本实验将人成骨细胞(MG-63)与人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVECs)直接共培养,观察HUVECs对MG-63功能的影响,为骨组织工程中血管再生研究工作提供依据。异体骨植入体内后,其生长和代谢状况受机体免疫系统的调节,临床上由于宿主免疫排斥反应或慢性炎症引起的植入骨吸收,坏死等情况经常发生。巨噬细胞等免疫细胞通过释放细胞因子而参与炎症、免疫反应等引起的骨破坏。巨噬细胞在吞噬了凋亡细胞以后能够发生抗炎性反应。磷脂酰丝氨酸(phosphatidyiserinePS)是细胞凋亡的表面标志,巨噬细胞通过识别细胞表面暴露的PS而吞噬凋亡细胞,进而发生一系列变化,参与炎症抑制反应。磷脂酰丝氨酸脂质体(phosphatidylserine liposome PSL)能够模拟凋亡细胞作用而参与免疫调节活动。因此PSL很有可能通过对免疫细胞的调节而参与炎症性骨破坏的调节。因此本研究中,我们通过对炎症性骨吸收动物模型的研究,检测PSL对免疫细胞及破骨细胞的调节作用,从而揭示PSL对炎症性骨破坏的作用,为临床上由于炎症、免疫排斥反应等引起的骨破坏和吸收的预防和治疗寻找一个新的思路和方法。实验方法1、nHAC/PLA支架材料对MG-63细胞附着生长及生物学功能的影响将培养的MG-63细胞接种于nHAC/PLA支架材料上,通过倒置显微镜观察其MG-63细胞在nHAC/PLA支架材料表面生长情况,并通过对支架-细胞复合体进行HE染色等方法对细胞在nHAC-PLA架材料上的早期附着生长情况进行研究。同时检测复合生长后的MG-63细胞细胞增殖指数,ALP活性、Realtime RT-PCR检测骨钙素、Ⅰ型胶原mRNA的表达量从而研究nHAC/PLA支架材料对人成骨细胞体外培养生物学功能的影响。2、CFDA SE标记观察人成骨细胞与骨支架材料附着情况。用CFDA SE标记人成骨细胞,接种于nHAC/PLA骨支架材料上,测定细胞的粘附率,并用激光共聚焦显微镜观察细胞在支架材料上的生长状况。3、脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)对人成骨细胞体外培养的影响。取MG-63与人HUVECs直接联合共同培养于培养皿中,通过对人成骨细胞内ALP活性和OC含量测定,观察HUVECs对人成骨细胞功能的影响。4、PSL对炎症性/免疫反应性骨吸收的影响使用慢性关节炎动物模型,PSL局部给药,观察其对免疫反应性骨吸收的影响,并通过检测炎症局部组织巨噬细胞浸润及相关炎症因子释放情况,探讨PSL影响骨吸收的机理。实验结果1、共聚焦显微镜及HE染色结果显示MG-63细胞在nHAC/PLA支架材料上生长良好;细胞增殖指数比空白对照组有显著性提高。在生物学功能方面,ALP活性、OC及Col-1基因mRNA相对表达量较对照组有也有显著性提高。2、CFDA SE标记的人成骨细胞的粘附率为(97.99±1.43)%,未标记的人成骨细胞粘附率为(98.57±1.17)%,两者无统计学差异(P＞0.05)。3、人成骨细胞与HUVECs直接联合共培养后,两种细胞均生长良好,人成骨细胞内ALP活性和OC定量测定结果,共培养组明显高于对照组。4、PSL对关节炎有明显的抑制作用,炎症组织中,PSL给药组IL-1β,TNF-α等炎症促进因子的释放量比对照组有明显降低,同时IL-10等炎症抑制因子的表达量明显高于对照组。同时PSL能够抑制全骨髓细胞系中破骨细胞的形成。结论1、nHAC/PLA支架有利于MG-63细胞的早期粘附、生长,能够促进人成骨细胞的生物学功能。是一种较好的骨组织工程的支架材料,可以用于骨组织工程研究和治疗工作中。2、荧光活性染料CFDA SE标记不影响MG-63细胞在nHAC/PLA骨支架材料上的粘附,可作为观察人成骨细胞在nHAC/PLA骨支架材料生长情况的实验手段。3、HUVECs在体外与人成骨细胞直接联合共培养中,有明显促进人成骨细胞活性的作用。4、PSL能够通过调节巨噬细胞活动,参与抑制炎症/免疫反应性骨吸收。