第一部分GDF-5在小鼠肢体骨骼发育中的表达和意义目的研究GDF-5基因在不同孕期小鼠胚胎肢芽组织中的表达情况,了解其在肢体骨骼发育中的表达规律,初步阐明GDF-5基因在肢体发育过程中的作用。方法选取清洁级2-3月龄昆明种小鼠30只,于每日下午6时按雌雄2∶1合笼,次日晨8时取出,查见阴道栓者定为孕期第0.5天。分别在胚胎11.5、12.5、13.5、14.5和15.5天颈椎脱臼处死孕鼠,无菌条件用眼科剪取肢芽组织备用。采用RT-PCR方法检测不同胚龄肢芽组织GDF-5 mRNA的表达变化,采用Western blotting方法检测不同胚龄肢芽组织GDF-5蛋白的表达变化。结果①小鼠胚胎肢芽组织GDF-5mRNA的表达规律:孕11.5到孕15.5天胚胎肢芽组织均可见一条219bp的GDF-5特异扩增条带,其与β-actin光密度值的比值分别为0.521±0.023,1.210±0.014,1.221±0.008,0.556±0.014,0.510±0.019。即小鼠肢体骨骼发育的早期阶段GDF-5mRNA持续表达,E11.5天肢芽组织刚刚形成时有少量表达,孕12.5和13.5天呈高表达,继而表达减弱,孕12.5和13.5天GDF-5mRNA的相对含量与其余3天相比有极显著性差异(P<0.01)。②小鼠胚胎肢芽组织GDF-5蛋白的表达规律:GDF-5蛋白表达规律与mRNA变化趋势相一致,孕11.5到孕15.5天胚胎肢芽组织均观察到分子量为13.7KDa的蛋白条带,其与β-actin蛋白光密度值比值分别为0.589±0.021,1.103±0.124,1.112±0.041,0.601±0.015,0.552±0.006,孕12.5到孕13.5天GDF-5蛋白的相对含量高于其余3天,且有极显著性差异(P<0.01)结论GDF-5 mRNA和蛋白在小鼠肢体骨骼发育早期阶段持续表达,孕12.5和13.5天呈高表达,继而减弱,说明GDF-5是肢体骨骼发育早期的一个关键因子,提示GDF-5在体内前软骨细胞聚集、软骨分化等过程中有很重要的作用第二部分pcDNA3.1(+)/GDF-5真核表达质粒的构建及其在小鼠骨髓基质干细胞的表达目的通过基因重组技术体外构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)/,并检测其在小鼠骨髓基质干细胞中的表达。方法根据Genbank中小鼠GDF-5序列设计并合成引物,提取孕14.5天小鼠胚胎肢芽组织总RNA,RT-PCR扩增,将扩增产物GDF-5基因片断插入至pcDNA3.1(+)载体并转化大肠杆菌DH5α,提取重组质粒,酶切鉴定及测序;脂质体介导pcDNA3.1(+)/ GDF-5重组质粒瞬时转染小鼠MSCs,细胞转染分为三组:实验组,用Lipofectamine TM2000进行pcDNA3.1(+)/GDF-5转染;实验对照组,转染空质粒pcDNA3.1(+);空白对照组,加入等量脂质体。然后采用RT-PCR和免疫细胞化学方法分别检测GDF-5 mRNA和蛋白的表达情况。结果重组质粒双酶切图谱显示有5.4kbp和1.6kbp两条带,分别为pcDNA3.1(+)和GDF-5的片断,表明GDF-5基因已经成功的插入到pcDNA3.1(+)载体上;基因测序结果通过BLAST程序分析显示目的基因序列与Genbank公布的小鼠GDF-5序列完全相同;转染后RT-PCR显示实验组有一219bp特异性扩增条带,而实验对照组和空白组均未出现条带,提示有基因转录的发生;免疫细胞化学检测发现实验组细胞胞浆内有棕色阳性染色,实验对照组和空白组细胞胞浆内无棕色染色,提示有GDF-5蛋白的表达。结论本实验成功构建pcDNA3.1(+)/GDF-5真核表达质粒,转染小鼠骨髓基质干细胞中有GDF-5基因的表达,体外进一步证实了GDF-5在肢体骨骼发育早期有很重要的作用。第三部分GDF-5对小鼠骨髓基质干细胞成软骨分化的定向诱导作用目的研究GDF-5对小鼠骨髓基质干细胞的定向诱导作用,探讨的其成软骨能力。方法体外培养小鼠骨髓基质干细胞,贴壁细胞传代,取第3代细胞,分5组进行诱导:A组:阴性对照组,培养液为无血清L-DMEM;B组:A组+地塞米松(10-7M)、VitC(50μg/ml)、胰岛素(6.25μg/ml)和GDF-5(10ng/ml);C组:A组+地塞米松(10-7M)、VitC(50μg/ml)、胰岛素(6.25μg/ml)和GDF-5(20ng/ml);D组:A组+地塞米松(10-7M)、VitC(50μg/ml)、胰岛素(6.25μg/ml)和GDF-5(50ng/ml);E组A组+地塞米松(10-7M)、VitC(50μg/ml)、胰岛素(6.25μg/ml)和GDF-5(100ng/ml)。培养14d后,倒置相差显微镜观察细胞形态及生长变化;MTT法测定不同浓度GDF-5对小鼠骨髓基质干细胞增殖的影响;RT-PCR和免疫细胞化学法检测不同浓度GDF-5对Ⅱ型胶原表达的影响;阿尔辛蓝(Alcian)染色蛋白多糖。结果倒置相差显微镜发现,B、C、D和E组MSCs由长梭形变为多边形,胞浆丰富,以D、E组最为明显,并且出现细胞聚集形成的细胞小结,而A组细胞形状变化不大,也无典型的细胞小结形成;MTT结果显示B、C、D、E组与对照组A的平均吸光值相比,差异无显著性意义,表明GDF-5诱导小鼠MSCs向软骨分化的过程中对细胞的增殖没有影响。RT-PCR结果显示A组对照组无Ⅱ型胶原mRNA的表达,B、C、D、E组均有表达,与β-actin光密度的比值分别为:B:0.384;C:0.423;D:0.638;E:0.865,B组到E组的Ⅱ型胶原的表达量依次增加,成剂量依赖关系;免疫细胞化学显示A组对照组有个别细胞染色阳性,B、C组弱阳性,D、E组强阳性,表明GDF-5能够促进MSC向软骨细胞分化并分泌Ⅱ型胶原蛋白,成剂量依赖性;Alcian染色结果显示A组对照组阿尔辛蓝染色阴性,B、C组呈淡染,D、E组成蓝色,并且可见细胞小结区域呈明显的异染性着色,表明GDF-5诱导细胞分泌蛋白多糖基质。结论GDF-5能够体外定向诱导小鼠骨髓基质干细胞向软骨方向分化并具有分泌软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白多糖基质的功能,50-100ng/ml为最佳剂量,为进一步从细胞和分子水平明确其在软骨分化机制中的作用奠定了实验基础。第四部分GDF-5诱导小鼠骨髓基质干细胞软骨分化过程中对Cx43蛋白表达的影响目的研究生长分化生长因子5(GDF-5)在小鼠骨髓基质干细胞软骨分化过程中对缝隙连接蛋白Cx43表达的影响,探讨GDF-5在软骨分化中的作用机制。方法体外培养小鼠骨髓基质干细胞(MSCs),贴壁细胞传代,取第3代细胞,分两组进行诱导:阴性对照组:培养液为无血清L-DMEM;实验组:地塞米松(10-7M)、VitC(50μg/ml)、胰岛素(6.25μg/ml)和GDF-5(100ng/ml)+对照组。在诱导24、48和72小时进行如下检测:MTT法测定GDF-5对小鼠骨髓基质干细胞增殖的影响;RT-PCR、Western blotting和免疫细胞化学法检测GDF-5对Cx43蛋白表达的影响。免疫细胞化学和阿尔辛蓝(Alcian blue)染色分别检测细胞诱导72小时软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达情况。结果MTT结果显示:不同时间点实验组与对照组的平均吸光值相比,差异无显著性意义,表明不同时间点GDF-5对小鼠MSCs增殖均没有产生影响;RT-PCR结果表明不同时间点对照组Cx43的相对量变化不大,24、48、72 h实验组Cx43的相对量与对照组相比有显著性差异,GDF-5诱导MSCs后Cx43 mRNA呈现高表达;Western blotting结果表明Cx43蛋白的表达与mRNA变化趋势大致相似,不同时间点实验组Cx43蛋白表达的相对量与对照组相比有显著性差异;Cx43蛋白免疫细胞化学染色结果表明对照组细胞均为阳性,但是阳性细胞数变化不大,不同时间点实验组阳性细胞率与对照组相比有显著性差异。Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色结果表明实验组呈阳性,对照组阴性,说明有软骨细胞特异性Ⅱ型胶原的表达;阿尔辛蓝(Alcian blue)染色结果表明实验组细胞阿尔辛蓝染色阳性,呈蓝色,对照组则无明显的异染性着色,说明GDF-5诱导小鼠MSCs分泌出软骨特异性蛋白多糖。结论GDF-5可以在诱导早期通过上调缝隙连接蛋白Cx43的表达来促进小鼠骨髓基质干细胞向软骨细胞方向分化,这也提示GDF-5在体外软骨诱导中的机制包括了Cx43介导的缝隙连接细胞间通讯途径。第五部分缝隙连接阻断剂1-庚醇在GDF-5体外诱导小鼠骨髓基质干细胞软骨分化中的作用目的研究缝隙连接阻断剂1-庚醇在GDF-5体外诱导小鼠骨髓基质干细胞软骨分化中的作用,进一步探讨GDF-5在软骨分化中的作用机制。方法体外培养小鼠骨髓基质干细胞,贴壁细胞传代,取第3代细胞,分3组进行诱导:对照组,培养液为无血清L-DMEM;GDF-5组:对照组+地塞米松(10-7M)、VitC(50μg/ml)、胰岛素(6.25μg/ml)和GDF-5(100ng/ml);GDF-5+1-庚醇组:GDF-5组+1-庚醇(2.5μmol/L)。在诱导72小时进行如下检测:RT-PCR和免疫细胞化学法分别检测Ⅱ型胶原的表达;Western blotting检测Cx43蛋白的表达;阿尔辛蓝(Alcian)染色蛋白多糖。MTT法测定1-庚醇对小鼠骨髓基质干细胞增殖的影响。结果MTT结果显示24、48、72h实验组与对照组的平均吸光值相比,差异无显著性意义,说明2.5μmol/L浓度1-庚醇对MSCs细胞增殖不产生影响,对细胞没有毒性抑制作用;RT-PCR结果显示对照组无Ⅱ型胶原mRNA的表达,GDF-5和GDF-5+1-庚醇组则均有表达,与β-actin光密度的比值分别为:0.527±0.013;0.386±0.008。GDF-5和GDF-5+1-庚醇组Ⅱ型胶原mRNA的相对量比差异有显著性意义;Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色结果显示对照组染色阴性,GDF-5组强阳性,GDF-5+1-庚醇组阳性,这均表明1-庚醇能够抑制GDF-5诱导MSC向软骨方向的分化。Alcian染色结果显示对照组阴性,GDF-5组呈广泛的蓝染,GDF-5+1-庚醇组染色较GDF-5组明显减弱,但仍成蓝色,说明1-庚醇能够抑制蛋白多糖的分泌。Western blotting结果表明Cx43蛋白相对量分别为:对照组0.326±0.004;GDF-5组0.582±0.006;GDF-5+1-庚醇组0.576±0.014,GDF-5和GDF-5+1-庚醇组与对照组相比有显著性差异,而GDF-5与GDF-5+1-庚醇组差异无显著性意义,说明GDF-5能够上调Cx43蛋白的表达,而1-庚醇Cx43的不产生作用。结论GDF-5能够定向诱导小鼠骨髓基质干细胞向软骨方向分化,软骨发生早期诱导Cx43蛋白高表达,继而缝隙连接细胞间通讯(GJIC)功能增强,从而促发其软骨分化,Cx43介导的GJIC在GDF-5诱导软骨分化中发挥着很重要的作用。