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河豚毒素,一种毒性极强的神经Na~+通道阻断剂,首先由Tahara(1909)从鲀科鱼(Tetrodontidae)体内发现并定名为Tetrodotoxin(TTX)。随后的研究中,河豚毒素在多种海洋脊椎动物、无脊椎动物和海底、淡水沉积物中被陆续发现,这些报道逐渐改变了人们以往认为的河豚毒素仅分布于鲀科鱼类的看法。目前,较被广泛接受的是河豚毒素外源性起源假说。 本实验在前人工作基础上,选取海藻希瓦氏菌(Shewanella alga)作研究对象,对其生产河豚毒素的情况进行了尝试性研究,获得较为理想的结果。基本实验步骤包括:菌种复活、纯化、培养条件选择、发酵产物内毒素分离、纯化及毒素测定等。经实验,选择CD-180离子交换树脂为柱层析材料,并创新性地将硅胶柱层析法与河豚毒素薄层层析技术结合起来分离纯化样品。实验结果较理想。 分离的毒素组分,用小鼠生物检测法确定为河豚毒素;反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进一步确证是河豚毒素类似物。分析条件:Waters600E液相系统,PDA996二极管矩阵检测器,Hypersil 5μm C18反相色谱柱(250×4.6mm i.d.),流动相:2mmol/L庚烷磺酸钠-0.05mol/L磷酸盐缓冲液,pH:6.8,检测波长:205nm,流速0.6mL/min,温度29℃,进样体积20μL。方法最低检测量20ng,线性范围1～200mg/L。同时,还采用荧光检测器进行了河豚毒素检测,分析条件为:Waters 2475多波段荧光分析色谱仪,717型自动进样器,Hypersil 5μm C18色谱柱(250×4.6mm i.d.),流动相:2mmol/L庚烷磺酸钠-0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液,pH6.8;2mol/L NaOH溶液作柱后衍生剂,反应盘管10m×0.3mm,衍生温度100℃,检测波长:激发波长381nm,发射波长505nm,流速0.5mL/min,柱温:29℃,进样体积20μL。方法最低检测量5ng,线性范围0.5～200mg/L。结果证实,荧光检测器相比紫外检测器更加灵敏,在排除与目标分离物保留时间接近的杂质干扰上优于紫外检测器:同时证实菌体破碎液中TTX类似物含量较菌液