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第一部分环孢素A对移植免疫耐受诱导的负向作用的研究目的:建立小鼠腹部异位心脏移植模型,探讨环孢素A对移植免疫耐受诱导的不同作用。方法:1:建立Balb/c→C57BL/6的小鼠心脏移植物急性排斥反应模型,实验组给予环孢素A(10mg/kg·qd)皮下注射,观察各组心脏移植物的生存时间;2:在移植术后7天,观察心脏移植物病理变化;3:流式细胞术检测移植术后7天各组脾脏T淋巴细胞Th1/Th2及Treg细胞亚群比例及活化诱导凋亡比例;4:PCR及western blot检测环孢素A对移植物局部NR4A1表达水平的影响。结果:1:CsA延长心脏移植物生存期,但CsA抑制Th1细胞亚群比例的同时也抑制Treg亚群比例及T细胞活化诱导凋亡,同时CsA导致小鼠肾功能损伤;2:移植术后心脏移植物局部NR4A1表达明显升高,CsA降低NR4A1蛋白量。结论:CsA对移植免疫耐受可能存在不同的作用,其对Treg及AICD的抑制不利于免疫耐受的诱导,且CsA导致小鼠肾功能损伤,其负向作用可能与NR4A1蛋白降低有关。第二部分激活NR4A1拮抗环孢素A对免疫耐受诱导的负向作用目的:探讨NR4A1在环孢素A抑制Treg、AICD及环孢素A诱导的肾间质纤维化中的作用,明确Csn-B拮抗环孢素A免疫耐受诱导负向作用的机制。方法:1:磁珠分选CD4T淋巴细胞,检测CsA及Csn-B对T细胞亚群分化及活化诱导凋亡的影响;2:体外培养小鼠肾间质成纤维细胞,检测Csn-B对CsA诱导成纤维细胞表型转化的影响;3:建立小鼠心脏移植及皮肤移植模型,单独给予CsA(10mg/kg·qd)或联合给予Csn-B(13mg/kg·qod)及CsA(10mg/kg·qd),观察各组移植物的生存时间,流式细胞术分析脾脏T细胞亚群比例及活化诱导凋亡比例。4:以低钠饮食喂养C57BL/6小鼠,给予CsA(30mg/kg·d)皮下注射,构建小鼠肾纤维化模型,Csn-B治疗组给予13mg/kg · qod腹腔注射,观察Csn-B对CsA诱导的肾功能损伤及间质纤维化的影响,PCR检测TGF-β信号通路致纤维化靶基因表达。结果:1:Csn-B增强了 CsA对Th1细胞的抑制作用,同时Csn-B能拮抗CsA抑制Treg亚群分化及T细胞活化诱导凋亡的作用;2:Csn-B联合CsA能明显延长皮肤及心脏移植物生存期,移植物局部炎性浸润明显减轻;3:Csn-B抑制CsA诱导的小鼠肾间质成纤维细胞表型转化;4:Csn-B减轻CsA导致的肾功能损伤及肾间质纤维化。结论:Csn-B拮抗环孢素A对Treg及AICD的抑制并减轻环孢素A导致的肾间质纤维化等免疫耐受诱导的负向作用,同时强化对Th1细胞的抑制作用,显著延长移植物生存期。第三部分CsA调控NR4A1表达及NR4A1调控TGF-β信号通路靶基因的机制研究目的:探讨CsA调控NR4A1的分子机制及NR4A1调控TGF-β信号通路靶基因的分子机制。方法:1:体外培养小鼠原代T细胞及EL4细胞,检测CsA对NR4A1表达的调控作用;2:使用免疫共沉淀证实生物信息学分析预测的VHL与NR4A1蛋白的相互作用;3:使用小干扰RNA敲低VHL表达,验证其在CsA调控NR4A1中的作用;4:ELISA检测CsA及Csn-B对小鼠肾脏成纤维细胞TGF-β表达水平的影响;5:PCR及Western blot检测CsA及Csn-B对小鼠肾间质成纤维细胞TGF-β信号通路靶基因的作用。结果:1:CsA促进NR4A1的降解;2:VHL与NR4A1存在相互作用,CsA通过VHL调控NR4A1;3:CsA促进成纤维细胞中TGF-β表达,Csn-B对其无影响;4:Csn-B抑制CsA上调的TGF-β信号通路靶基因的表达。结论:CsA通过VHL促进NR4A1的降解,Csn-B不影响TGF-β的表达,但抑制CsA激活的TGF-β信号通路靶基因的表达。