肢体缺血再灌注(IR)损伤主要发生于肢体挤压伤患者的病理转归过程中。因伤者得不到及时有效的复苏治疗,在延迟复苏中将出现严重的IR损伤。肢体被挤压的时间越长,IR损伤表现越重。最严重者可引发多器官功能衰竭而危及患者生命。在多器官中,肾脏是最易累及的靶器官。为此,防治肾脏损伤是救治此类患者的关键环节。在对一氧化碳(CO)的研究中发现,在机体遭遇器官IR损伤的病理条件下,CO具有细胞保护效应。本课题组前期的研究证实,使肢体缺血(4 h)再灌注(6 h)大鼠吸入低浓度的CO(体积分数为0.05%),可显著减轻肢体IR引发的肾等多脏器损伤。但CO具有舒张阻力血管的生物效应,吸入CO对肢体严重挤压伤的患者有何影响,尚不得而知。目的:本实验拟通过夹闭股动脉8 h再开放的方法复制肢体严重IR损伤模型,使模型动物吸入含CO的医用空气后,观测肾功能及肾组织病理学指标的变化,以探讨吸入CO对肢体严重缺血再灌注所致肾脏损伤的效应,为最终将吸入CO的办法应用于防治肢体创伤型“多衰”提供实验依据。方法:(1)动物分组:健康雄性SD大鼠56只,随机分为IR组(24只)、IR +CO(RC)组(24只)、假手术(S)组(8只)。在IR、RC组中,8只用于10 d存活率的观测;8只于再灌注6 h时取材,另8只于再灌注12 h时取材,用于肾功能指标及病理学观测。S组中,4只与再灌注6 h组对比观测,另4只与再灌注12 h组对比观测。(2)模型复制:本实验采用无创血管夹夹闭双侧股动脉,并用橡皮筋绑扎后肢根部,以此造成双侧后肢缺血。根据文献提示,并经本实验证实,缺血达8 h以上者再灌注后血压下降,呈现休克表现。据此,本实验将缺血时间确定为8 h,以此建立肢体严重IR动物模型。S组动物模拟手术过程,但不造成肢体缺血。(3)吸入CO的方法:RC组动物吸入CO,把动物置于特制的器皿中,通入含有低浓度CO的医用空气,CO的体积分数为0.075%。于再灌注前2 h时开始持续吸入含有CO的医用空气,直至再灌注后4 h,共计吸入6 h。S、IR组暴露于空气中,自由呼吸。(4)10 d存活率观测:IR、RC组各取8只大鼠,于再灌注过程中,观测尾动脉收缩压的变化和10 d存活率。(5)肾功能指标的测定:IR、RC组,分别于再灌注6 h、12 h时,S组于对应的手术后时间点,在深度麻醉下经右心房采血各5mL,静置,离心,取上清液送全自动生化分析仪检测血钾(K+)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)等肾功能指标。(6)湿干重比(W/D)测定:上述动物经心房采血后,开腹取出左侧肾脏,用电子分析天平测量其湿重,在60℃电热恒温培养箱中干燥7天,待肾脏水分完全析出后测其干重,算得W/D。(7)病理学观察:取上述动物右侧肾脏,先对其颜色、质地、肿胀程度、渗出情况及坏死粘连程度,进行大体观察。其后,将肾脏切开进行固定,石蜡包埋、切片,HE染色,光镜观察肾组织病理学变化。结果:(1)10 d存活率:IR组,再灌注后大鼠尾动脉收缩压开始降低,其下降过程可区分为四个时相:第一时相,再灌注0-2 h,为血压快速下降期,至2 h前后,尾动脉平均收缩压为8.6708±0.5992 kpa;第二时相,再灌注2-4 h,下降幅度较小,为血压相对稳定期;第三时相,再灌注4-8 h,为血压缓慢下降期,至再灌注8 h时尾动脉平均收缩压为5.3259±0.3832 kpa;第四时相,再灌注8 h-死亡,为持续低血压期,尾动脉收缩压波动在5 kpa上下,动物处于持续休克状态,再灌注13-14 h间有6只大鼠死亡,另外2只于再灌注至20 h前后死亡,10 d存活率为0。RC组,尾动脉收缩压的下降速率较慢、下降幅度较小,与IR组的四个时相比照:第一时相,血压也快速下降,但下降幅度显著变小,再灌注至2 h前后,尾动脉平均收缩压为10.3843±1.3111 kpa;第三时相,血压下降的速率和幅度均明显降低,至再灌注8 h时尾动脉平均收缩压为8.3300±0.4224 kpa;第四时相,血压未出现下降且稳中有升,至再灌注13 h时尾动脉平均收缩压为9.4157±0.3305 kpa,8只大鼠中1只在再灌注至20 h前后死亡,其余7只再灌注10 d后仍存活,且状态良好,10 d存活率为7/8。(2)肾功能指标的变化:S组血清k+、CRE和BUN值最低,处于基础水平,在正常参照范围之内;IR组血清k+、CRE和BUN值最高;RC组血清k+、CRE和BUN值居中。S、IR、RC三组间比较,均有统计学差异(P<0.05)。(3)W/D:S组< RC组< IR组。IR组和S组、RC组相比,均有统计学差异(P<0.05),RC组与S组相比,无统计学差异(P>0.05)。(4)病理学大体观察结果:S组,肾脏颜色暗红,形态正常,弹性好,无出血及渗出物;IR组,肾脏明显肿胀,色泽深暗,被膜下可见大量血色渗出液,再灌注12 h者较6 h者肾脏病变更为明显;RC组,肾脏肿胀程度较IR组明显减轻,颜色较IR组浅,被膜下血色渗出液明显减少,再灌注12 h者较6 h者改善明显。(5)肾组织病理学观察结果:S组,肾小管上皮、肾血管内皮细胞形态正常,胞浆均匀、红染,胞核无变形,核仁清晰,无炎性细胞浸润。IR组,肾小管上皮胞体增大,部分细胞变性、坏死,或溶解、破坏,或空泡状,肾小管管腔变窄,腔内可见大量嗜酸性管型;肾小球充血,嗜酸性增强,嵌顿细胞数明显增多,内皮细胞肿胀明显,毛细血管管腔狭窄,肾小球血管内有大量已破坏的红细胞;肾小球内、肾小管间有大量中性粒细胞浸润,并广泛出血;再灌注12 h者病理改变较6 h者更为严重,部分肾小球明显缩小。RC组,与IR组比较,肾组织病理学表现明显改善,但仍可见部分肾小管上皮细胞变性、空泡化,肾小管间有少量单核细胞浸润,出血减轻,再灌注12 h者较6 h者改善明显。?结论:(1)大鼠肢体缺血8 h者,再灌注过程中血压明显下降,出现休克表现,10 d存活率为0,以此可复制肢体严重IR模型。(2)及早给予外源性低浓度CO,可稳定动物血压,防止休克发生,显著提高肢体严重IR损伤大鼠的生存率。(3)及早给予外源性低浓度CO,可显著减轻肢体严重IR所引发的肾脏损伤,改善肾功能。(4)本研究结果提示,经气道给予低浓度(安全范围内)的CO,对肢体挤压伤、断肢再植术等引发的肾等多器官损伤可能有切实的防治效应,且成本低廉、操作简便。