论文部分内容阅读
手性化合物由于其独特的光学活性，广泛应用于医药、食品、化工、农药等领域，随着对不同光学异构体药物药理作用的研究进展和对外消旋药物申报和使用的种种限制，手性药物成为近年来研究的热点和方向。光学纯醇类化合物是手性药物合成的重要中间体。利用微生物或其细胞内的氧化还原酶催化潜手性酮的不对称还原已成为制备高光学纯度手性醇的重要方法。本文以2’-氯-苯乙酮作为模型底物，研究了水相中酵母全细胞催化芳香酮类化合物不对称还原反应的特性，并通过条件优化提高了反应效率，强化了反应过程。从酵母细胞内分离纯化出具有不对称催化能力的氧化还原酶——羰基还原酶（CAR），并通过基因重组技术，构建了能有效表达羰基还原酶基因的重组大肠杆菌。在重组CAR不对称还原2’-氯-苯乙酮的过程中，通过底物耦联体系，成功地实现了辅酶NADH的原位再生。工作的主要内容包括：（1）从实验室保存的七株酵母菌株中筛选出高效高选择性还原2’-氯-苯乙酮为（S）-2’-氯-苯乙醇的酵母Candida pseudotropicalis 104（C．104）。研究了助溶剂乙醇含量对酵母还原产率的影响，比较了不同的水／有机溶剂两相反应体系中的还原效率，最后选择了无助溶剂的单一水相中酵母细胞催化还原高浓度2’-氯-苯乙酮作为反应体系。不溶性底物在振荡的状态下呈微小液滴状分散于缓冲液中。在加入20g/L的葡萄糖作为辅助底物时，20 gDCW（dry cell weight，细胞干重）／L的酵母可将19．48 mmol／L的2’-氯-苯乙酮完全转化，反应初速度达到33．27 mmol／（h·gDCW），反应体系中的b／s（生物催化剂与底物质量之比：酵母细胞干重gDCW／底物质量g）值为6.7。酵母细胞在短时间内可耐受高达233．8 mmol／L（约36g/L）。的底物浓度，反应24小时产物浓度可达58．4 mmol／L。24小时以后，高浓度的底物和产物均会令酵母细胞失去活性甚至死亡。但在较低底物浓度（6．49 mmol／L）条件下，酵母细胞的耐受性提高，可以多次重复使用，使用16次以后产率仍能达到100％。（2）对酵母细胞进行超声波破碎，提取出粗酶液，经过DEAE离子交换层析和Blue sepharose蓝色琼脂糖亲和层析分离后，获得了电泳纯的的羰基还原酶（CAR）。最终酶活回收达到22．4％，比活力为15．8 U／mgPr，纯化倍数为2980倍。纯化的CAR表现出了比酵母细胞更高的催化选择性，产物S构型2’-氯-苯乙醇的对映体过剩（e．e．）值达到100％。（3）对纯化的羰基还原酶的酶学性质作了研究，该酶以NAD（H）为辅酶，可以不对称催化酮的还原及相应醇的氧化反应。酶的最适温度为50℃，催化氧化反应的最适pH为8．5，催化还原反应的最适pH在6．0到6．5之间。CAR的热稳定性较差，在30℃以上时酶蛋白迅速变性失活；酶蛋白对环境pH的变化比较敏感，仅在pH值7．0至8．5之间较为稳定。多数金属离子对酶催化具有抑制作用，EDTA的加入对酶活的影响不明显。CAR具有广泛的底物特异性，可以催化还原多种芳香族和脂肪族酮类化合物，以及相应醇类的氧化反应。反应结果显示，羰基还原酶对还原底物的活力大小受到羰基附近位阻效应和电荷诱导效应的双重影响，但以位阻效应为主要影响因素。羰基还原酶对芳香酮类化合物具有很高的立体选择性，对苯乙酮、2’-氯-苯乙酮、3’-氯-苯乙酮、4’-氯-苯乙酮、3-氯-1-苯丙酮和2-氯-2’，4’-二氟苯乙酮还原产物的e．e．值都达到100％，其反应方式遵循Prelog反应规则。（4）从酵母C．104中成功扩增得到CAR基因片断，连接到表达质粒pET28a（+）中，构建得到重组菌Ecoli BL21（DE3）（pET28a-CAR）。经过IPTG诱导表达，其比活达到0．24 U／mgPr，为酵母C．104（0．0053 U／mgpr）的40多倍。利用Ni-NTA Agarose亲和层析，从重组菌E．coli BL21（DE3）（pET28a-CAR）中纯化出了重组CAR，重组CAR与酵母细胞中分离出的CAR具有相同的酶学性质。用相同的引物分别从酵母Saccharomyces cerevisiae B5、Candida utilis 1257、Pichia membranaefaciens和Saccharomyces cerevisiae 4742中扩增出与CAR基因序列相同的基因片段，说明CAR基因在多种酵母细胞中存在，具有高度的保守性。（5）应用重组CAR不对称催化还原2’-氯-苯乙酮，通过加入异丙醇或仲丁醇作为辅助底物，建立了底物耦联反应体系实现辅酶NADH原位再生的反应体系。对反应条件和反应的动力学作了研究：反应的最适温度为30℃，最适pH为7．0，CAR催化还原2’-氯-苯乙酮的动力学参数：Km=0．693 mmol／L，Vmax=0．017μmol／min（[NADH]：0．06mmol／L）。根据反应平衡动力学，推导出底物耦联反应的平衡公式（仲丁醇为辅助底物）为Keql·Keq2=[P][butone]/[S][2-butanol]。