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哺乳动物毛色主要取决于黑色素沉积,而黑色素生成主要受黑色素细胞调控,黑色素细胞产生不同种类的黑色素,以及这些色素的不同分布致使哺乳动物形成多种毛色类型。在现代毛兔和皮兔产业中,白色被毛在制成服装等制品前需染色,给环境和消费者健康造成影响,而纯天然的彩色被毛不会存在此问题,也更受消费者青睐。要解决这个问题,势必要深入解析家兔被毛色素沉积机理,为毛色改造和新型毛色品种培育提供理论依据。然而目前,兔的永生化黑色素细胞系至今尚未建立,导致兔的毛色形成机制和黑色素沉积机理研究滞后。本研究围绕家兔黑色素细胞永生化细胞系的建立及鉴定,为主要内容开展研究,并以此为素材,初步分析色素沉积关键基因——小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor gene,MITF)的表达模式和功能。所建立的永生化黑色素细胞系为研究兔皮毛黑色素沉积规律提供一个理想的体外细胞模型,同时为进一步揭示皮毛动物的色素沉积的分子机制奠定了基础。本实验结果如下:1、根据课题组前期建立家兔黑色素细胞体外培养体系,利用两步酶消化法分离家兔原代皮肤黑色素细胞,并以此为基础,经过纯化筛选,获得较纯的黑色素细胞。构建pLVX-IRES-Puro-SV40LT慢病毒表达载体,经慢病毒包装及鉴定,确定MOI为100时感染效率最高。利用慢病毒感染原代黑色素细胞72 h,2.0 μg/mL puromycin筛选1周后,1.0 μg/mL puromycin维持培养2周,挑选单克隆,经扩大培养,得到1株培养代数超过50代永生化家兔黑色素细胞系。2、通过显微镜观察,永生化细胞形态上保持了原代细胞的基本形态特征,呈多极状,折光性强;经L-DOPA染色,细胞中呈现棕黑色颗粒;S-100、TYR、TYRP1和MITF免疫荧光染色为阳性,表明建立的永生化细胞仍具有正常黑色素细胞特性。通过黑色素细胞系的生长曲线与细胞周期测定,发现黑色素细胞系增殖活力与原代细胞相一致,依然保持正常的增殖水平;通过核型分析,永生化细胞染色体数目为44条,与正常原代黑色素细胞数目一致,仍具有正常核型;在软琼脂实验中,悬浮状态下黑色素细胞系未发生分裂增殖,注射裸鼠亦未发现瘤块,与正常的黑色素细胞没有差别,说明永生化细胞未发生癌变,可作为工具细胞使用。3、根据NCBI预测与文献报道,设计MITF编码区特异性引物,采用RT-PCR结合TA克隆测序的方法,鉴定了兔MITF基因的6种可变剪接体,分别命名为MITF X1、MITF X2、MITFX3、MITFX4、MITFX5 和 MITFX6(GenBank 登录号:MK801776、MK825547、MK85548、MK825549、MK825550和MK825551)。构建MITF不同剪接体的过表达载体,转染到永生化黑色素细胞中,通过荧光定量检测发现MITF X1-X3过表达显著增加了 TYR、GPNMB的mRNA表达量(P<0.05),其它MITF剪接体的过表达对下游基因影响不显著(P>0.05);黑色素含量测定发现,MITFX1-X6剪接体显著增加了黑色素细胞中总黑色素和真黑色素含量(P<0.05),均可影响黑色素细胞黑色素沉积。综上可知,建立的家兔永生化黑色素细胞可作为理想的体外细胞模型,代替原代细胞用于皮毛动物色素沉积的相关研究。