研究背景恶性神经胶质瘤是最常见的成人颅内原发性恶性肿瘤,尽管存在手术切除、放射治疗、化学药物治疗等多种治疗手段,仍然是人类最为难治的肿瘤之一。做为其中恶性程度较高的一种亚型,胶质母细胞瘤的5年期生存率不足3%。其难治性的主要原因之一在于胶质瘤组织中过度的病理性血管生成。过度血管生成是大多数恶性肿瘤的生物学特征并且在神经胶质瘤中与其恶性程度相关。有文献报道在胶质瘤的一种亚型星形细胞瘤中,恶性程度高的肿瘤呈现出较高的微血管密度。血管生成过程处于体内一系列具有促进或者抑制作用的细胞因子的动态调节之下。在这一高度复杂的生理或者病理过程中,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)做为一种重要的促血管生成细胞因子受到广泛关注,并被认为在血管生成的调节过程处于中心地位。与血管生成相似,有报道称胶质瘤组织中VEGF的浓度与其恶性程度直接相关。在胶质瘤组织微环境中,胶质瘤细胞和外周浸润来的髓样细胞均是VEGF的重要来源。尽管髓样细胞所占比例远小于胶质瘤细胞,但它在肿瘤血管生成过程中发挥的作用是不可替代的,这可能是由于髓系来源的VEGF-A (VEGF的一种亚型)对于VEGF受体2的磷酸化的独特作用,而VEGF受体2正是VEGF作用于内皮细胞从而介异血管生成的主要受体。在过去几十年中,研究者们逐步认识到抗血管生成疗法是一处有效的抗肿瘤措施,也有多种抗血管生成药物表现出良好的肿瘤治疗效果。这些产品主要针对性作用于VEGF的信号传导过程,包括VEGF抗体如贝伐单抗(bevacizumab), VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂如舒尼替尼(sunitinib)、西地尼布(cediranib)以及VEGF假受体(VEGF-TRAP)等。抗血管生成药物主要通过两种方式影响肿瘤的生长。首先,通过阻断营养物质和氧气的运输抑制肿瘤细胞的生长；其次,抗血管生成药物能够使得异常迂曲的肿瘤血管网获得短暂的正常化,从而增强同步应用的放射疗法或者化学药物疗法的疗效。尽管许多研究已经证实了这些抗血管生成疗法在改善患者预后方面的有效性,但上述抗血管生成药物的作用仍不能令人满意,一些毒副作用如高血压、蛋白尿及血栓栓塞事件仍时有发生。因此,一种新型的内源性抗血管生成因子——可溶性内皮细胞生长因子受体1(soluble VEGF receptor1, sFlt-1)——越来越多的受到研究者们的关注。sFlt-1由Kendall等人于1993年克隆发现,是膜结合型VEGF受体1的一种特殊剪切体。在结构上与膜结合型VEGF受体1相比,sFlt-1保留了与配体结合的胞外结构域,但缺少跨膜及胞内结构域。因此,sFlt-1虽能够与配体VEGF结合但不能产生胞内信号传导,加之sFlt-1与VEGF-A的亲和力远大于VEGF受体2,就形成了对VEGF与其受体2结合的竞争性抑制。另外,sFlt-1还可与膜型VEGF受体形成异二聚体,阻断受体自身的磷酸化,以显性负性复合体的形式阻断VEGF信号的传导。在人体内,sFlt-1主要由血管内皮细胞产生,但有些肿瘤细胞如神经胶质瘤细胞和髓系细胞如单核细胞也是sFlt-1的来源。在神经胶质瘤方面,有文献报道sFlt-1与其组织内的VEGF浓度、微血管密度、肿瘤的恶性程度及其预后相关。也有数项靶向基因治疗研究证实了其在神经胶质瘤治疗方面的有效性。Harding等人以rAAV为载体将sVEGFR1/R2转入皮下移植胶质瘤模型中,发现肿瘤体积明显缩小,宿主生存期明显延长,而将此载体直接注入颅内原位胶质瘤中能起到比全身应用更好的效果。Goldman等人用转染有sFlt-1基因的胶质母细胞瘤细胞建立颅内原位胶质瘤模型发现,转染有sFlt-1基因的小鼠预后明显更佳。地钱素C (marchantin C)是一种专门从地钱类植物中提出的大环双联苯类化合物的家庭成员,目前的研究显示它们具有多种生物学功能,如细胞毒、抗肿瘤及抗真菌等。地钱素C作为成员之一其具体的生物学作用尚未得到深入研究,但目前研究结果中显示的对人神经胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭的抑制以及对肿瘤微管的抑制提示了其做为抗胶质瘤治疗药物的较大潜力。褐藻多糖(fucoidan)是一种富含L-岩藻糖(L-fucose)和酯基的硫酸多糖,提取自褐藻类植物和海胆等海洋无脊椎动物,又称为聚海藻糖、岩藻聚糖或者硫酸聚海藻糖。褐藻多糖同样具有多样的生物学功能,包括抗凝血、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、抗自由基、抗补体及抗炎症等作用。到目前为止,还未见有关地钱素C或者褐藻多糖对sFlt-1产生的影响方面的报道,而已有的研究结果表明这两种药物具有抗血管生成的作用。因此在本研究中,我们选择这两种药物研究它们对于神经胶质瘤微环境中两种主要的VEGF来源细胞胶质瘤细胞和单核细胞分泌sFlt-1的影响以及进一步的对这两种细胞诱导的血管生成的影响,以求寻找一种更加安全有效的抗血管生成策略以对抗恶性胶质瘤。第一部分：地钱素C对胶质瘤微环境中血管生成的影响及机制研究研究目的1.研究地钱素C对人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1分泌sFlt-1的影响。2.研究地钱素C对人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1诱导的血管生成的影响。3.研究sFlt-1在地钱素C影响人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1诱导的血管生成过程中的作用。4.研究地钱素C影响人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1分泌sFlt-1的相关细胞因子和机制。研究方法1.地钱素C对人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1分泌sFlt-1的影响。取生长良好的T98G和THP1细胞以每孔105个细胞加入6孔细胞培养板,12h后加入不同浓度的地钱素C(终浓度分别为1μM、5μM、10μM),继续培养6h,12h,24h。刺激结束后收集条件刺激上清行ELISA检测sFlt-1的表达水平。2.地钱素C对人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1诱导的血管生成的影响。T98G细胞和THP1细胞经地钱素C(5μM)刺激24h后取细胞培养上清进行HUVEC成管功能试验。96孔板每孔铺基质胶70μl,每孔加入等量细胞悬液和条件上清的混合液200μ l,每孔细胞数105个,6h后显微镜下拍照记录。取每孔三个视野内分散的内皮细胞形成的管状结构间分叉点的数目的平均值对成管能力进行定量计算。3. sFlt-1在地钱素C影响人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1诱导的血管生成过程中的作用。T98G细胞和THP1细胞经地钱素C(5μ M)刺激24h后取细胞培养上清进行HUVEC成管功能试验。设对照组,药物刺激组和抗体处理组。药物刺激组为药物刺激后的细胞培养上清,对照组为未经药物刺激的细胞培养上清中加入与刺激量相同的地钱素C,抗体处理组为在药物刺激后的细胞培养上清中加入2μg/ml的sFlt-1特异性阻断抗体并室温孵育0.5h。96孔板每孔铺基质胶70μ l,每孔加入等量细胞悬液和条件上清的混合液200μ l,每孔细胞数105个,6h后显微镜下拍照记录。取每孔三个视野内分散的内皮细胞形成的管状结构间分叉点的数目的平均值对成管能力进行定量计算。4.地钱素C影响人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1分泌sFlt-1的相关细胞因子和机制。1)T98G细胞和THP1细胞经地钱素C(5μ M)刺激24h后收集细胞提取mRNA,逆转录后行Real-time PCR检测sFlt-1mRNA的表达。2)T98G细胞和THP1细胞经地钱素C(5μ M)刺激24h后收集细胞行流式细胞术检测细胞膜上VEGFR1的表达。3)T98G细胞和THP1细胞经地钱素C(5μ M)刺激24h后收集细胞提取mRNA,逆转录后行Real-time PCR检测MMP-2,7,9,12mRNA的表达。4)取生长良好的T98G和THP1细胞以每孔105个细胞加入6孔细胞培养板,12h后分别加入终浓度为20μ M的ERK1/2信号通路阻断剂U0126或10μM的p38信号通路阻断剂SB203580,24h后收集细胞行Real-time PCR检测MMP-7mRNA的表达。结果1.地钱素C对人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1分泌sFlt-1的影响。在24h作用时间下,随着药物浓度的增高,T98G细胞的sFlt-1的分泌水平呈先上升后下降的趋势,THP1细胞的sFlt-1的分泌水平却无显著性变化。选择5μM的作用浓度,随着作用时间的延长,T98G细胞的sFlt-1的分泌水平呈逐渐上升的趋势,THP1细胞的sFlt-1的分泌水平仍无显著性变化。2.地钱素C对人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1诱导的血管生成的影响。地钱素C能够抑制T98G胶质瘤细胞诱导的血管生成,而sFlt-1分泌水平无显著变化的THP1单核细胞诱导的血管生成却无显著变化。对成管能力的定量分析也进一步明确了地钱素C对T98G胶质瘤细胞诱导的血管生成具有显著的抑制作用。3. sFlt-1在地钱素C影响人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1诱导的血管生成过程中的作用。与对照组相比,地钱素C刺激后(5μ M,24h)的T98G细胞条件培养上清明显抑制了HUVEC的成管能力,经sFlt-1特异性抗体的免疫性清除后其成管能力有显著的恢复,达到与对照组相当的水平。对成管能力的定量分析进一步明确了这一作用。4.地钱素C影响人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1分泌sFlt-1的相关细胞因子和机制。1)地钱素C刺激后的T98G胶质瘤细胞的sFlt-1mRNA水平下降。2) VEGFR1在T98G细胞膜表达量极少,地钱素C对此无影响。3)地钱素C刺激后的T98G胶质瘤细胞中MMP-7的转录水平明显下降,而MMP-2,9,12则未见明显变化。4)ERK1/2信号通路的阻断剂U0126能显著抑制MMP-7的转录,而p38信号通路的阻断剂SB203580却对T98G胶质瘤细胞中MMP-7的转录无明显影响。结论1.地钱素C促进人脑胶质瘤细胞系T98G分泌sFlt-1,不影响人单核细胞系THP1分泌sFlt-1。2.地钱素C抑制人脑胶质瘤细细系T98G诱导的血管生成,不影响人单核细胞系THP1诱导的血管生成。3. sFlt-1介导地钱素C对人脑胶质瘤细细系T98G诱导的血管生成的抑制作用。4.地钱素C抑制人脑胶质瘤细细系T98G中MMP-7的转录,与ERK1/2信号通路相关。第二部分：褐藻多糖对胶质瘤微环境中血管生成的影响及机制研究研究目的1.研究褐藻多糖对人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1分泌sFlt-1的影响。2.研究褐藻多糖对人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THPl诱导的血管生成的影响。3.研究sFlt-1在褐藻多糖影响人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THPl诱导的血管生成过程中的作用。4.研究褐藻多糖影响人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1分泌sFlt-1的相关机制。研究方法1.褐藻多糖对人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1分泌sFlt-1的影响。取生长良好的T98G和THP1细胞以每孔105个细胞加入6孔细胞培养板,12h后加入不同浓度的褐藻多糖(终浓度分别为10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml),继续培养6h,12h,24h。刺激结束后收集条件刺激上清行ELISA检测sFlt-1的表达水平。2.褐藻多糖对人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1诱导的血管生成的影响。T98G细胞和THP1细胞经褐藻多糖(100μg/ml)刺激24h后取细胞培养上清进行HUVEC成管功能试验。96孔板每孔铺基质胶70μl,每孔加入等量细胞悬液和条件上清的混合液200μl,每孔细胞数105个,6h后显微镜下拍照记录。取每孔三个视野内分散的内皮细胞形成的管状结构问分叉点的数目的平均值对成管能力进行定量计算。3. sFlt-1在褐藻多糖影响人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1诱导的血管生成过程中的作用。T98G细胞和THP1细胞经褐藻多糖(100μg/ml)刺激24h后取细胞培养上清进行HUVEC成管功能试验。设对照组,药物刺激组和抗体处理组。药物刺激组为药物刺激后的细胞培养上清,对照组为未经药物刺激的细胞培养上清中加入与刺激量相同的褐藻多糖,抗体处理组为在药物刺激后的细胞培养上清中加入2μ g/ml的sFlt-1特异性阻断抗体并室温孵育0.5h。96孔板每孔铺基质胶70μl,每孔加入等量细胞悬液和条件上清的混合液200μ l,每孔细胞数105个,6h后显微镜下拍照记录。取每孔三个视野内分散的内皮细胞形成的管状结构间分叉点的数目的平均值对成管能力进行定量计算。4.褐藻多糖影响人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1分泌sFlt-1的相关细胞因子和机制。1)T98G细胞和THP1细胞经褐藻多糖(100μg/ml)刺激24h后收集细胞提取mRNA,逆转录后行Real-time PCR检测sFlt-1mRNA的表达。2)T98G细胞和THP1细胞经褐藻多糖(100μg/ml)刺激24h后收集细胞行流式细胞术检测细胞膜上VEGFR1的表达。结果1.褐藻多糖对人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1分泌sFlt-1的影响。在24h作用时间下,随着药物浓度的增高,T98G细胞和THP1细胞的sFlt-1的分泌水平均呈逐渐升高的趋势。选择100μg/ml的作用浓度,随着作用时间的延长,T98G细胞和THP1细胞的sFlt-1的分泌水平均呈逐渐升高的趋势。2.褐藻多糖对人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1诱导的血管生成的影响。褐藻多糖能够明显抑制T98G胶质瘤细胞和THP1单核细胞诱导的血管生成。对成管能力的定量分析也进一步明确了褐藻多糖对T98G胶质瘤细胞和THP1单核细胞诱导的血管生成具有显著的抑制作用。3. sFlt-1在褐藻多糖影响人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1诱导的血管生成过程中的作用。与对照组相比,褐藻多糖刺激后(100μ g/ml,24h)的T98G细胞条件培养上清和THP1单核细胞条件培养液上清明显抑制了HUVEC的成管能力,经sFlt-1特异性抗体的免疫性清除后其成管能力有显著的恢复,达到与对照组相当的水平。对成管能力的定量分析进一步明确了这一作用。4.褐藻多糖影响人脑胶质瘤细胞T98G和人单核细胞THP1分泌sFlt-1的相关机制。1)褐藻多糖刺激后的T98G胶质瘤细胞的sFlt-1mRNA水平显著升高,THP1单核细胞的sFlt-1mRNA水平无明显变化。2) VEGFR1在T98G细胞膜表达量极少,褐藻多糖对此无影响。褐藻多糖显著降低了THP1细胞膜上VEGFR1的表达。结论1.褐藻多糖促进人脑胶质瘤细胞系T98G和人单核细胞系THP1分泌sFlt-1。2.褐藻多糖抑制人脑胶质瘤细胞系T98G和人单核细胞系THP1诱导的血管生成。3.sFlt-1介导褐藻多糖对人脑胶质瘤细胞系T98G和人单核细胞系THP1诱导的血管生成的抑制作用。4.褐藻多糖促进人脑胶质瘤细胞系T98G中sFlt-1的转录。5.褐藻多糖促进人单核细胞系THP1细胞膜上VEGFR1的降解。