赤魟(Dasyatis akajei)白细胞介素8(Interleukin-8)的功能研究与进化分析

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以我国南海海洋生物软骨鱼赤魟作为研究对象,综合应用基因工程、蛋白纯化等分子生物学、细胞生物学和生物信息等功能基因组研究方法和技术手段进行研究。在实验室已克隆的赤魟白细胞介素8(IL-8)基因序列的基础上,对趋化因子家族重要成员的IL-8进行进化与功能的分析和研究,并且制备了多克隆抗体,为利用免疫学方法进一步研究提供了必需的辅助材料。以期开发软骨鱼赤魟的分子生物学资源,并在阐明IL-8基因在鱼类中的生理活性机制基础上,为其潜在应用价值提供直接的实验证据支持。 氨基酸序列分析表明,赤魟IL-8具有保守的四个半胱氨酸(Cys),且N端为CXC,属于CXC型趋化因子。和其它已报导的鱼类IL-8一样,赤缸IL-8缺乏经典的ELR motif,并且与人、鼠等哺乳类的IL-8氨基酸序列同源性较低。不同于哺乳动物中IL-8序列的高度保守,已报道的鱼类中的IL-8序列相似性也较低,这可能跟鱼类中IL-8 正在高速进化有关。 选取赤魟IL-8的成熟肽构建了硫氧还蛋白(TRX)融合表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了原核表达。以0.2mM IPTG做诱导剂25℃过夜诱导表达12小时,成功获得了可溶的重组融合蛋白rTRX-IL8。采用Ni<2+>螯和亲和层析和G25分子筛等纯化步骤获得到了较高纯度的重组IL-8成熟蛋白。HPLC分析纯化后的重组IL-8蛋白纯度在80~90﹪之间。 制备了多克隆抗体,Western blotting结果显示纯化后的抗体特异性良好,Dotblotting检测抗体效价达到了1:50,000。为利用免疫学方法进一步研究IL-8基因,及其表达产物的性质、功能以及调节炎症反应及抑制肿瘤迁移的可能作用机制等提供了必需的辅助材料。对赤魟重组IL-8的生物学活性进行了研究。赤魟重组IL-8对豚鼠中性粒细胞的体外趋化实验结果显示其确实具有中性粒细胞趋化功能,并且这种趋化作用呈浓度依赖性。赤魟的IL-8虽然缺乏ELR motif,依然具有趋化中性粒细胞的功能,让我们联想到鱼类中IL-8趋化功能的行使可能与ELR motif不具有直接关联。此外,斑马鱼腹腔注射低浓度的重组IL-8蛋白12小时后,可以观察到其腹部有白细胞聚集现象。 本研究对赤魟IL-8在分子进化及功能研究方面提供了依据。对赤魟IL-8的进化分析、蛋白表达、生物学活性等方面的研究,为阐明鱼类中IL-8的功能和趋化因子的进化奠定了良好的基础。
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