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猫1型疱疹病毒（Feline herpesvirus I,FHV-1）和猫杯状病毒（Feline calicivirus,FCV）是引起猫上呼吸道疾病（Upper respiratory tract disease,URTD）的两大主要病毒性病原体,FHV主要引起鼻气管炎,也称为猫病毒性鼻气管炎病毒,而FCV常引起口炎、牙龈炎和舌局限性病变。FHV-1在寒冷季节（春季和冬季）的流行率高于温暖季节（夏季和秋季）,FCV的流行率则不受天气影响,均具有高度流行性。两种病毒生命力均较顽强,对猫群体的健康构成了极大威胁。本研究旨在建立基于RPA-Cas12a和RPA-Cas13a系统的猫I型疱疹病毒（FHV-1）与猫杯状病毒（FCV）的快速检测方法并进行临床验证。根据FHV-1与FCV基因组序列分析与比对结果,分别以FHV-1 TK基因序列和FCV的ORF1基因序列为靶标设计cr RNA和RPA扩增引物。将本研究建立的方法与SYBR Green荧光定量PCR法进行对比,从RPA引物筛选、灵敏性、特异性和临床样本检测等方面评价FHVRPA-Cas12a和FCV RPA-Cas13a方法的有效性。再在单重病原检测法的基础上,建立基于双重RPA-Cas12a/Cas13a的荧光与侧流层析试纸条检测法,以实现对猫1型疱疹病毒（FHV-1）与猫杯状病毒（FCV）的同时检测。本研究取得的成果如下:1.FHV-1与FCV的检测靶点筛选与引物设计从NCBI上下载FHV-1-TK与FCV参考株序列,对全基因以及靶区域序列进行多重序列比对。经进化树结果表明,FHV-1基因序列高度保守,FCV则呈现丰富的遗传多样性。对筛选的12株FHV-1参考株TK基因比对结果其同源性达99.89%,18株FCV ORF1中的片段基因同源性达95.8%,在锁定区域分别设计了RPA-FHV-F/R与RPA-FCV-F/R引物、FCV-cr RNA与FHV-cr RNA序列。经筛选后选择RPA-FHV-F2/R1与RPA-FCV-FX3/R为最优引物对,且靶向目的基因的检测低限均达单拷贝数,表现出良好的灵敏度与特异性,为FHV-1与FCV的核酸检测方法的建立提供基础材料。2.FHV-1-Cas12a和FCV-Cas13a核酸检测方法的建立及应用使用荧光定量PCR反应检测系统监测其荧光强度,以及结合化学发光成像系统和测流层析试纸条进行验证。将本研究建立的方法与SYBR Green荧光定量PCR进行对比,从灵敏度、特异性和临床样本检测等方面评价FHV RPA-Cas12a和FCV RPA-Cas13a方法的有效性。结果表示建立的FHV RPA-Cas12a方法与FCV RPA-Cas13a方法均可实现靶基因的准确检测,同时与其他猫相关病原无交叉反应,特异性良好,且灵敏度均高于SYBR Green荧光定量PCR法,可检测至单拷贝数的质粒模板。其中FHV-Cas12a检测法最低检测限为2.35×10-1copies/μL,FCV-Cas13a检测法最低检测限为5.5×10~0copies/μL。最后使用两种方法分别对20份和56份具有临床症状的临床样本进行检测,对第一批样本（20份）进行FHV-1检测,其中SYBR Green q PCR法检出率为25%（5/20）,FHV-Cas12a法的FHV-1检出率为35%（7/20）。对第二批样本（56份）进行FCV检测,SYBR Green RT-q PCR法检出率为42.8%（24/56）,FCV-Cas13a法的FCV检出率为67.8%（38/56）,其病原检出率均高于SYBR Green q PCR法。上述结果表明,建立的FHV-Cas12a和FCV-Cas13a检测法可以作为FHV-1和FCV临床快速诊断的工具。3.RPA-CRISPR-Cas12a/13a对FHV-1与FCV双重检测方法的建立与初步应用在反应体系中分别结合Cy5与FAM探针,利用化学激发光进行多重彩色成像输出检测结果,同时使用侧流层析试纸条进行验证。该检测法的灵敏度与特异性与单重检测法一致。对第三批具有典型临床症状的临床样本（56份）进行检测,FHV-1检出率为33.9%（19/56）;FCV检出率为37.5%（21/56）;FHV-1与FCV双阳性检出率为12.5%（7/56）对两种病毒的检出率均高于荧光定量PCR法。最后又初步尝试了RPA与Cas12a/Cas13a一步法检测,在40°C-42°C,60 min条件下可完成检测。本研究建立的FHV-1-Cas12a、FCV-Cas13a单重核酸检测方法具有高灵敏度和检测耗时短的特点,所涉及的设备相对简单,无需复杂的变性、退火、延伸步骤来进行靶标的扩增,仅37°C恒温条件就能实现病原检测。随后在单重检测体系的基础上建立了RPA-Cas12a/Cas13a的双重检测法,并结合于测流层析试纸条,实现了对FHV-1与FCV的同时检测以及结果可视化。本研究建立的基于CRISPR-Cas系统的检测方法可不依赖于专用设备、反应过程快速便捷、检出率高,对于临床上相应病原的现场快速诊断方面具有应用价值。