论文部分内容阅读
研究目的:探究脱细胞干细胞基质(DSCM)促进滑膜间充质干细胞(SMSCs)成半月板软骨分化及抑制软骨细胞肥大化的分子机制,明确信号通路中关键作用分子,构建体外促进SMSCs成软骨分化及抑制软骨细胞分化体系,为解决SMSCs在半月板软骨组织工程中遇到的问题及临床上半月板钙化找到有效的方案。研究方法:将SMSCs于传统培养瓶(Plastic)成软骨诱导分化2周后,去除培养基中转化生长因子-β(TGF-β),降低地塞米松浓度,加入甲状腺激素进行软骨细胞肥大化诱导培养,探究软骨细胞肥大化对半月板修复的影响;将SMSCs分别置于传统培Plastic和DSCM扩增培养后,置于Pellet系统中成软骨诱导分化,检测Sox9、Col1a1、Col2a1、aggrecan、GAG等纤维软骨相关标志物及ALP、MMP-13、Col10a1等细胞肥大化相关标志物,探究DSCM抑制软骨细胞肥大化作用;将经DSCM扩增培养的SMSCs置于Pellet系统中成软骨细胞诱导分化培养,检测Wnt5a的表达量;成软骨培养中分别依次加入Wnt5a受体抑制剂UM206、Erk磷酸化抑制PD98059、p38 MAPK抑制剂SB203580检测软骨相关和肥大化相关标志物,探究Wnt5a等信号通路介导DSCM促进SMSCs成软骨分化、抑制软骨细胞肥大性分化的分子机制;体外条件下,于传统成软骨诱导培养基中加入Wnt5a激动剂,探究Wnt5a是否作为DSCM促进SMSCs成软骨分化、抑制软骨细胞肥大性分化的关键因子。结果:SMSCs具有很强的贴壁生长能力,成脂、成骨、成软骨诱导检测阳性。与成软骨诱导培养比较,SMSCs在甲状腺激素刺激肥大化诱导培养基中扩增培养后,其细胞形态出现明显的肥大化表型。诱导分化28天后,软骨小球中软骨细胞仍然表现肥大化状态。对软骨小球中的I型胶原(COLI)进行免疫组化染色,结果显示经过成软骨培养基诱导形成的软骨小球,其染色强度较经肥大化培养基诱导分化成的软骨小球强。X型胶原(COLX)在经过成软骨培养基诱导的软骨小球中染色几乎呈现阴性,但在肥大化培养基诱导分化的软骨小球中其染色呈现强阳性。PCR结果显示肥大化诱导促进肥大化相关基因表达。将SMSCs分别置于含有和不含有DSCM的培养瓶中培养,不含DSCM培养瓶中的SMSCs表现出肥大化细胞形态,而置于DSCM中扩增培养的SMSCs保持其干性形态。将经“Plastic”扩增培养的SMSCs分别转入“DSCM”和“Plastic”中扩增培养,被转入到“DSCM”中扩增培养的SMSCs密度增高,而转入到“Plastic”中扩增培养的SMSCs密度没有明显变化;将经“DSCM”扩增培养的SMSCs分别转入到“Plastic”和“DSCM”中扩增培养,被转入到“DSCM”中扩增培养的SMSCs密度没有明显的变化,而转入到“Plastic”中扩增培养的SMSCs密度却明显的降低。DSCM可以显著增加SMSCs增殖能力及成软骨指数,即增加GAG/DNA比值。与在Plastic中成软骨分化细胞,SMSCs在DSCM中扩增培养后形成的软骨小球体积显著增加,同时COLI的表达量也显著的增加。RT-PCR对成软骨分化过程中Col1a1分子进行检测,结果显示,与Plastic相比,DSCM可以显著的增加Col Ia1的表达。将SMSCs置于DSCM中成软骨诱导培养,结果显示,诱导产生的软骨小球Pellet体积变大、GAG及COLII合成量增加,肥大化标志基因Col X、ALP及MMP-13表达被抑制。SMSCs分别置于传统培养瓶Plastic和DSCM中扩增培养8天,然后置于Pellet系统中进行成软骨诱导分化35天。分别采用RT-PCR和West blot对SMSCs成软骨分化阶段Wnt5a表达量进行检测,结果显示,在SMSCs增殖培养阶段,DSCM中Wnt5a表达量约是Plastic中Wnt5a表达量的5倍,而于成软骨诱导分化阶段,DSCM中Wnt5a表达量约是Plastic中Wnt5a表达量的5倍。SMSCs分别置于含有Wnt5a和不含有Wnt5a的传统培养瓶中扩增培养8天,同样的,经Wnt5a扩增培养的SMSCs成软骨分化能力较强。Wnt5a能够明显的促进纤维软骨基因表达,同时能够抑制ALP、MMP-13、Runx2、Col10a1等肥大化相关基因的表达。SMSCs分别置于含有PD98059和不含有PD98059的传统培养瓶Plastic中及含有PD98059和不含有PD98059的DSCM中扩增培养8天,结果显示,SMSCs于含有PD98059的培养基中扩增时,其增殖能力较对照组显著减弱。SMSCs分别置于含有SB203580和不含有SB203580的传统培养瓶Plastic中及含有SB203580和不含有SB203580的DSCM中扩增培养后成软骨诱导分化。结果显示,SMSCs于含有SB203580的培养基中扩增时,其成软骨分化能力较对照组显著减弱。结论:体外条件下,SMSCs诱导分化成的软骨细胞具有肥大化现象,使生的半月板版软骨出现钙化。DSCM可以促进SMSCs成软骨分化,抑制肥大性分化。DSCM中Wnt5a作为关键作用分子,具有促进SMSCs成软骨分化、抑制软骨细胞肥大化作用。传统培养基中加入Wnt5a分子,SMSCs成软骨分化作用被增强,软骨细胞肥大化作用被抑制。利用Wnt5a解决半月板组织工程中软骨细胞肥大化、新生半月板软骨钙化是一种可行的方法。