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目的:肝积方是导师王雄文教授的经验方,具有疏肝健脾、活血化瘀的功效。前期通过临床和动物研究初步证明肝积方具有抑瘤护肝、促进凋亡等作用。在前期研究的基础上,结合细胞实验、网络药理学分析和全基因组DNA甲基化测序（WGBS）进一步探讨肝积方作用于乙肝相关性肝细胞癌（HBV-HCC）的分子机制,可为肝积方后续的机制研究和临床应用提供科学依据。方法:（1）细胞实验中,MTT法用于研究肝积方对Hep G2和Hep G2.2.15细胞株增殖的抑制作用,并计算半数抑制率(IC50);细胞划痕实验用于分析肝积方对细胞迁移的影响;Annexin V/PI双染色法用于分析肝积方对Hep G2和Hep G2.2.15细胞株细胞周期和凋亡的调控作用。（2）为进一步探讨肝积方干预HBV-HCC的分子机制,网络药理学用于分析肝积方作用于HCC的分子机制和关键靶点。首先从TCMSP数据库中筛选得到肝积方的潜在活性成分;TCMSP和Swiss Target Prediction数据库用于获取各个化合物相应的蛋白靶点;TCGA数据库中差异表达的m RNA及差异甲基化位点和一系类的公共数据库中分析得到的关键靶点被视为HCC中的关键靶点。将肝积方中潜在活性成分预测得到的蛋白靶点映射到HCC中的关键靶点中,可得到肝积方作用于HCC的关键靶点。利用String数据库构建蛋白质与蛋白质之间的相互作用网络,Cytoscape中的Cyto Hubba插件进行网络拓扑分析以筛选关键的靶点。使用R语言中“cluster Profiler包”对这些关键靶点进行GO及KEGG富集分析。利用Cytoscape软件构建“活性成分-靶点-通路-疾病”的网络图,利用分子对接技术探索肝积方中关键活性成分与靶点的结合能力,q RT-PCR用于验证通路和表型相关分子的m RNA表达水平。（3）WGBS被视为DNA甲基化研究的“金标准”,结合亚硫酸氢盐处理和高通量测序,从全基因组甲基化的角度对HBV-HCC进行表观遗传特征的分析。在我们的研究中,我们选取12例HCC癌组织和配对正常的肝组织（APTs）进行WGBS分析。根据HBV DNA病毒载量的不同,我们将12组病人分为高载量HBV DNA表达组、低载量HBV DNA表达组和HBV DNA表达阴性组。分别获得了三组之间的癌组织与APTs间的差异甲基化区域（DMRs）和差异甲基化基因（DMGs）,DMGs用于进一步的GO和KEGG富集分析。TIMER数据库用于验证核心靶点在各个癌种中的差异表达,GEPIA数据库用于验证基因高低表达的不同群体间的生存差异,CBio Portal数据库用于分析核心靶点的遗传突变情况。结果:（1）在细胞实验中,MTT结果显示,肝积方可抑制Hep G2.2.15和Hep G2细胞株的增殖,且其抑制作用呈浓度依赖性。肝积方作用于Hep G2.2.15细胞株的24H、48H和72H的IC50分别为1.25mg/ml、0.90mg/ml、0.68mg/ml;肝积方作用于Hep G2细胞株的24H、48H和72H的IC50为1.91mg/ml、1.56mg/ml、1.12mg/ml。细胞划痕实验结果显示,肝积方能够抑制Hep G2.2.15和Hep G2细胞株的迁移,药物浓度越高,抑制迁移的能力越强。Annexin V/PI双染色法表明肝积方可阻滞Hep G2.2.15和Hep G2细胞株于G0G1期,且其阻滞作用呈浓度依赖性。肝积方可抑制Hep G2.2.15和Hep G2细胞株总凋亡率,且其抑制作用呈浓度依赖性。与对照组相比,各个浓度的肝积方组与对照组相比,各组间的差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）在TCMSP数据库和Swiss Target Prediction数据库中,联合文献报道,肝积方中12味中药总共筛选得到162个活性化合物和826个相应的蛋白靶点。我们对TCGA数据库中筛选到的差异m RNA和差异甲基化位点与公共数据库筛选到的一系列靶点取交集,总共筛选得到611个HCC相关的靶点,最后得到63个肝积方作用于HCC的关键靶点。通过对这63个靶点进行GO和KEGG富集分析,这些靶点参与的生物学过程、细胞组分和分子功能中排名最靠前的分别为上皮细胞增殖、细胞-底物连接、细胞粘附分子结合。排名前五的通路分别为:细胞周期、细胞衰老、p53信号通路、PI3K-Akt信号通路、孕激素介导的卵母细胞成熟。为探讨肝积方干预HCC的分子机制,我们对PI3K-Akt信号通路进行了进一步的验证。Cytohubba插件筛选得到肝积方作用于HCC的潜在核心标靶排名前10位分别为:HSP90AA1、SRC、CDK1、CCNA2、CDK4、PLK1、CDK2、TOP2A、AURKB和CDK6;PI3K-AKT通路中可见CCNE1、PKN1、CCND2、CDK4、EPHA2、FGFR3、CDK6、CDK2和HSP90AA1富集。我们将这10个靶点与PI3K-AKT通路中富集到的靶点取交集,我们猜测,HSP90AA1、CDK2、CDK4和CDK6可能是肝积方作用于HCC的关键靶点。为探索肝积方中发挥抗癌作用的主要活性物质,分子对接技术用于分析靶点和化合物的结合能力,肝积方中筛选得到的8个活性成分（Anhydroicaritin,Cubebin,（2R）-7-hydroxy-5-methoxy-2-phenylchroman-4-one,paeoniflorin,albiflorin＿qt,bisdemethoxycurcumin,pachymic acid,7,9（11）-dehydropachymic acid）与2个潜在靶点（HSP90AA1,EPHA2）的对接得分均小于-4.0,表明它们具有一定的结合活性。其中,paeoniflorin和HSP90AA1的结合能最强为-7.3,pachymic acid和EPHA2间的结合能最强为-8.8。因此,paeoniflorin和pachymic acid可能在肝积方干预HCC的过程中具有较高的药物活性。最后,我们在Hep G2和Hep G2.2.15细胞株中对PI3K-Akt信号通路中相关的分子进行了验证,q RT-PCR的结果显示,肝积方可使Hep G2和Hep G2.2.15细胞株中PIK3R1、AKT1的表达水平降低,肝积方可降低肝癌细胞株中周期相关蛋白（CCND1、CDK2、CDK4、CDK6）达水平,同时提高周期相关蛋白CDKN2A的表达水平;对于凋亡相关的蛋白,肝积方可促使Bax、Bim表达水平上升,同时降低Bcl-2的表达水平。在Hep G2细胞株中,肝积方可促使EPHA2、HSP90AA1表达水平降低,而在Hep G2.2.15细胞株中,肝积方并不能有效抑制EPHA2的表达水平。（3）我们在HBV DNA高载量的癌组织与APTs之间检测到311,901个高甲基化水平的DMRs和13,734个低甲基化水平的DMRs,HBV DNA低载量的癌组织与APTs之间检测到376,068个高甲基化水平的DMRs和12,083个低甲基化水平的DMRs,HBV DNA阴性的癌组织与APTs之间检测到85,412个高甲基化水平的DMRs和8,316个低甲基化水平的DMRs。DMRs注释下的DMGs主要在代谢相关通路、癌症相关通路、PI3K-Akt信号通路、神经活性配体-受体相互作用、局灶性粘连以及Rap1信号通路发挥作用。通过合并三组之间的差异甲基化基因,我们可获得HBV-HCC中的差异甲基化位点。结合上述网络药理学的分析结果,我们获得了5个肝积方可能作用于HBV-HCC的关键靶点,包括EPHA2、HSP90AA1、CDK6、PKN1和FGFR3。我们对PI3K-Akt通路及可能在该通路上游的EPHA2和HSP90AA1在TCGA数据库中进行了验证,结果显示EPHA2和HSP90AA1在多种癌种中均差异表达。其中,EPHA2在HCC中为低表达,这与我们的猜想并不一致,可能需要进一步的验证。HSP90AA1在HCC中为高表达,其低表达均与较好的预后相关。EPHA2和HSP90AA1的m RNA表达水平均与DNA甲基化水平呈负相关。然而,我们的WGBS测序数据显示EPHA2在HCC中为低甲基化状态,HSP90AA1为高甲基化状态。在CBio Portal数据中,我们进一步探讨了EPHA2和HSP90AA1的总体突变率,结果显示EPHA2的突变率为1.9%,HSP90AA1的突变率为1.4%。综合上述结果,PI3K-Akt通路在肝积方干预HBV-HCC的过程中发挥着关键作用,EPHA2和HSP90AA1的临床应用价值仍需要进一步的验证。结论:细胞实验结果表明肝积方可抑制HBV相关性肝癌细胞增殖、迁移,并促进G0/G1期周期阻滞和凋亡。为探索肝积方作用于HBV-HCC的分子机制,利用网络药理学和q RT-PCR技术,我们对肝积方干预HCC的分子机制进行了猜测和验证。网络药理学结果显示,肝积方可通过PI3K-Akt信号通路抑制肝癌细胞的增殖,诱导肝癌细胞G0/G1期周期阻滞,并促进肝癌细胞的凋亡。我们猜想,EPHA2和HSP90AA1可能是PIK3-Akt上游的关键靶点,也是肝积方发挥作用的关键靶点。WGBS进一步验证了PI3K-Akt信号通路及EPHA2和HSP90AA1在HBV-HCC中的重要作用。本研究结论可为肝积方深入的分子机制探讨和临床应用提供科学依据。